RAPD分子标记及其在油茶遗传育种研究中的应用（综述）

RAPD分子标记及其在油茶遗传育种研究中的应用（综述）

完成机构：中南林业科技大学国家林业局经济林育种与栽培重点实验室,湖南长沙410004

王世伟的主要研究成果

1.Shi-Wei Wang，Min Wang．Breeding of NHase hyper-producing Rhodococcus ruber strain LUV30-06 and Verification of mutants by RAPD．The　6th International Conference on Bioinformatics and Biomedical Engineering (iCBBE2012)，Shanghai，China. (2012) 4：486-490．（EI）
2.Shiwei Wang，Qinghui Wang，Ying Zhai1，Min Wang．Screening of NHase high-producing Rhodococcus ruber Strain TQD-58 by Both Parents Inactivated Protoplast Fusion．2012 International Symposium on Information Technology in Medicine and Education(ITME2012), Hokkaido，Japan.(2012)：737-740 (EI)．
3.Shiwei Wang，Yujie Dai，Jianxin Wang，Yanbing Shen，Heng Zheng，Min Wang．Title: Molecular insights into substrate specificity of Rhodococcus ruber CGMCC3090 by Gene Cloning and Homology Modeling．Enzyme and Microbial Technology (accepted，SCI)．
4.王世伟;王敏.腈类物降解菌多样性和产腈水合酶研究进展,中国生物工程杂志,2011,31(9):117-123
5. 王世伟，杨晓杰，王中革，杨小花，李旭业，冯柠，RAPD分子标记对高粱DNA经花粉管导入玉米自交系的验证，齐齐哈尔大学学报(自然科学版) 2011，27（1）：54-60
6.刘军,王世伟,赵凯,周东坡,白蚁的生物防治现状与研究进展, 微生物学杂志,2010 (2):91-94
7. 王世伟，姜丽娟，李旭业，外源DNA经花粉管通道法导入玉米及后代分子验证研究进展，高师理科学刊，2010，30（2）：76-80
8.王世伟，李旭业，张伟伟.优化感受态细胞制备方法提高转化效率的研究.齐齐哈尔大学学报（自然科学版），2009，25（2）:86-90
9.王世伟，张伟伟，刘军等.基因与细胞工程大实验教学体系的建立与实践.高师理科学刊，2008（5）:118-120
10.王世伟，马玺，平文祥等.微生物发酵生产紫杉醇研究进展.微生物学通报，2007，34（3）:561-565
11.王世伟，董原，李铁等.一种适合抗癌药紫杉醇产生菌AFLP分析的DNA提取方法.高师理科学刊. 2006，26（1）:561-565
12．王世伟，王福全，马玺等.杉醇产生菌及其工程菌株之间的AFLP遗传差异分析.生物技术. 2004，15（3）:15-17
13．齐小辉，马玺，赵凯，王世伟等.线粒体DNA及其应用. 生物技术通讯. 2004，14（5）413-415
14．马玉超，赵凯，王世伟等.产紫杉醇(Taxo1)内生真菌的生物多样性.菌物研究. 2003，1（1）: 28-32
15．张鹏，王世伟，解玉红等.紫杉醇产生菌的细胞总核酸提取. 生物技术. 2003，13（2）:21-23
16．王世伟，齐小辉，刘军等. (2003) AFLP技术在微生物分类鉴定、基因标定及遗传多样性方面的应用. 生物技术.13（5）:42-43

遗传作图的DNA分子标记

DNA 分子标记大多是以DNA片段电泳谱带形式表现的。依其遗传特性可分为显性和共显性标记2种；依多态性检测手段可分为以Southern杂交技术为核心的分子标记和以PCR技术为核心的分子标记；根据在基因组中出现的频率，又可分为低拷贝序列和重复序列标记。
限制性片段多态性
RFILP是第—种用于研究的DNA标记。限制性核酸内切酶是一种在特定序列上切割DNA分子的酶，用它处理一个DNA分子时，即产生限制片段。这种序列特异性意味着用一种限制酶处理一种DNA分子总会产生同样的片段。但对于基因组DNA来说，并不总是这样。这是因为有些限制位点具多态性，以两种等位形式存在。一种等位形式有正确的限制位点序列，能被酶切开；另一等位形式的序列有改变，从而该限制位点不能被识别。后者的结果是在核酸内切酶处理后，两个相邻的限制片段仍然连接在一起，从而导致了长度多态性（如图1）。这就是一个RFLP的例子。如同用基因作为标记一样，RFLP在基因组图谱上的位置可以通过追踪其等位基因的遗传而得到。人类基因组中大约有100000个RFLP，但是理所应当的每个RFLP只能有两种等位形式（有或没有这个位点），这就限制了RFLP在人类基因作图上的应用价值，因为一个家庭的所有成员很可能都是某一个RFLP的纯合子。（简单来说，它不能区分纯合子和杂合子）。
随机扩增片段长度多态性标记
（Random Amplified Polymorphic DNA ，RAPD)RAPD技术是由Williams等首先创立的一种DNA分子标记技术，利用单一的10个碱基寡核苷酸作为引物，对基因组DNA进行PCR扩增。经琼脂糖凝胶电泳来检测DNA序列多态性。
扩增片段长度多态性
（Amplified Fragment Length Polymorphism ，AFLP)AFLP是Zeabeau 等（1993）发明的一项技术，它既有RFLP的可靠性，又有RAPD的方便性。其基本原理是通过PCR 扩增基因组DNA片段，扩增产物的变性聚丙烯酰胺电泳显示扩增片段长度多态性，其中引物=接头+酶切位点+2～3个核苷酸。
AFLP技术分析流程：⑴DNA 模板制备；⑵提取样本DNA 经浓度和质量检测后，一般采用双酶（EcoRI和MSEI或PstI或TaqI）酶切， 在基因组DNA上产生低频和高频切口；⑶选择性扩增酶切片段。酶切后，限制性片段在T4连接酶作用下与特定接头连接，形成带有接头的特异性片段；⑷PCR前扩增，一般用带一个选择性引物进行预扩增，反应条件与常规PCR反应基本一致；⑸利用放射性同位素标记或荧光标记PCR 引物；⑹在Taq聚合酶作用下完成94 ℃变性30s ，65 ℃淬火30s，72 ℃延伸60s，PCR扩增36个循环；⑺PCR产物在含尿素聚丙烯酰胺上电泳；⑻将电泳后的凝胶转移到吸附滤纸上，经干胶仪进行干胶处理；⑼在X光片上感光，数日后冲洗胶片并进行结果分析。
AFLP反应起始一般高温复性（一般65 ℃），因此只有那些与3’端严格配对的片段才能得到扩增，选择性很强。实验结果稳定，重复性好，呈典型的孟德尔式遗传，每个AFLP可以获得50～100条谱带信息，多态性强。
微卫星
（Microsatellite）微卫星是指以几个（1～6 bp) 核苷酸为单位，多次串联重复序列，也称之为简单重复序列（single sequence repeats ，SSR） 、短串联重复序列（short tandem repeats ，STR）或简单序列长度多态性（single sequence length polymorphism ，SSL P）。广泛分布于真核生物基因组中，大约每隔10～50bp就有一个微卫星，由于重复次数和重复程度的不完全而造成每一个位点的多态性。
单核苷酸多态性
（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）基因组中存在单个的点突变，且数量极大，有些也对产生RFLP，但许多并个能。这是囱为它们所处的序列不能被限制件内切核酸酶所识别。在人类基因组中，据认为有200000个以上的SNP(single nucleotidc polymorphism）位干基因内．而且有更多的SNP位于非基因的DNA中。
每个SNP只有两个等位基因，所以这些标记在人类绘制遗传图谱方面又与RFLP同样的缺点：对于一个SNP，很可能—个家族的所有成员都是纯合子。SNP的优点是它数目庞大，而且对SNP分型所用的方法不需凝胶电泳。这非常重要，因为已证明凝胶电泳很难实现自动化，所以使用它的检测方法相对缓慢而且费力。由于SNP以寡核苷酸杂交分析（oligonucleotide hybidization analysis）为基础，故其检测更快速。寡核苷酸是在试管中合成的通常小于50个核苷酸的短单链DNA分子。在适当的条件下，一个寡核苷酸与另一个DNA分子仅在可形成完全的碱基配对结构时才能杂交。如果有一个错配，寡核昔酸上就有一个位置不能形成碱基对。则不能杂交（图1）。因此寡核苷酸杂交能区分一个SNP的两个等位基因。筛选策略包括：
DNA芯片（DNA chip）技术
DNA芯片是一块面积为2cm平方或更小的硅片，以高密度排列方式携带有许多不同的寡核苷酸。待测DNA用荧光标记后加到芯片的表面。用荧光显微镜观察杂交情况，显示荧光信号的位置即表示该处的寡核苷酸与待测DNA发生了杂交。因此一个实验中可以量化许多SNP。
动态等位基因特异的杂交（dynamic allele-specific hybridization,DASH) 在这种技术中，杂交在溶液中进行，比如在96孔微量滴定板的一个孔中进行G荧光标记只能与双链DNA结合，因此只有发生了杂交才能检测到信号。开始，杂交在允许有错配的条件下进行。在这个阶段，无论待测DNA含有哪一种SNP等位基因，寡核苷酸都能与之杂交。由于错配的杂交产物不如完全杂交产物稳定，故在较低温度解链．因此可以通过升高温度来区分等位基因。这样就可以从使杂交依赖性荧光信号消失的温度来判定待测DNA中存在哪一种等位基因。

利用RAPD可以鉴定两个物种吗？又是怎样鉴定的？

可以

随机扩增多态性 DNA( RAPD) （ random amplified polymorphic DNA ）和任意引物 PCR(AP-PCR) （ arbitrary primer PCR ）

RAPD （ random amplified polymorphic DNA ）是 1990 年美国杜邦公司科学家 J. G. K. Williams 和加利福尼亚生物研究所 J. Welsh 领导的两个小组几乎同时发展起来的一项新技术。 Williams 称之为 RAPD （ random amplified polymorphic DNA ） ， Welsh 称之为 AP-PCR （ arbitrary primer PCR ）。 RAPD 技术建立在 PCR 技术基础上，它是以任意序列的寡核苷酸单链 ( 通常为 10 个碱基， AP-PCR 则为 20 ～ 30 个碱基 ) 为引物，对所研究的基因组 DNA 进行随机扩增。 RAPD 所用的一系列引物的 DNA 序列各不相同，但对于任一引物，它同基因组 DNA 序列有特定的结合位点。这些特定的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合 PCR 扩增的反应条件，即在一定范围内模板 DNA 上有与引物互补的反相重复序列时，就可扩增出此范围的 DNA 片段。在不同物种基因组 DNA 中，这种反相重复序列的数目和间隔的长短不同，就可导致这些特定的结合位点分布发生相应的变化，而使 PCR 扩增产物增加、减少或发生分子量的变化。 通过对 PCR 产物的检测和比较，即可识别这些物种基因组 DNA 的多态片段。

与常规 PCR 相比， RAPD 主要有以下特点： ① 无需专门设计 RAPD 扩增反应的引物，也无需预知被研究的生物基因组核苷酸顺序，引物是随机合成或是任意选定的。引物长度一般为 9 ～ 10 个寡核苷酸。 ② 每个 RAPD 反应中，仅加单个引物，通过引物和模板 DNA 链随机配对实现扩增，扩增没有特异性。 ③ 退火温度较低，一般为 36℃ ，这能保证短核苷酸引物与模板的稳定配对，同时也允许了适当的错误配对，以扩大引物在基因组 DNA 中配对的随机性。 ④ 较之常规 PCR ， RAPD 反应易于程序化。利用一套随机引物，得到大量 DNA 分子标记，可以借助计算机进行系统分析。

该方法已被广泛用于遗传指纹作图、基因定位、系统进化以及动植物、微生物物种及中药材的鉴定等各个领域。在生药鉴定方面，该方法在人参及其伪品、甘草、黄连、冬虫夏草及其伪品、贝母等药材的鉴定中有应用。

/static/upload/image/2023/1120/domain_profile.cfm id='柽柳科的研究成果'>柽柳科的研究成果

中国科学院新疆生态与地理研究所完成的《柽柳科植物研究》项目通过了专家鉴定。科研人员在柽柳科植物的属、种划分，系统与演化研究等方面取得突破性进展，阐明了柽柳科属植物的分布格局与环境的关系，建成世界上第一个柽柳科植物种质资源库。他们还提出柽柳科植物保护策略，成功克隆出3个具有独立自主知识产权的抗旱基因，为新疆的生态建设提供了柽柳苗木及柽柳栽培育苗技术。
专家认为，其研究成果对柽柳科植物生物多样性保护、可持续利用、干旱区退化生态系统恢复与重建及科学管理具有重要的理论价值和实践意义。其研究思路与方法对干旱区其他植物资源研究与保护利用也有借鉴作用。
以中国科学院新疆生地所尹林克研究员为项目组长的“柽柳科植物研究及生物多样性保护”成果通过新疆自治区科技厅组织的专家鉴定。
该项目由四个相关课题组成：国家自然科学面上基金项目“中国柽柳科植物的及生物多样性保护”；中国科学院“西部之光”人才培养计划项目“柽柳科植物的系统演化与应用研究”；中国科学院生物区系特别支持费项目“柽柳科系统学研究及中国柽柳科分类学修订”；中国科学院新疆生态与地理研究所领域前沿项目“柽柳抗渗透胁迫的分子机理研究”。
该项目针对柽柳科植物的系统学研究及生物多样性保护，做了大量的理论与应用研究。首次采用多学科相互印证和专科专属系统研究相结合的方法，解决了柽柳科系统学研究中长期存在的科学争议，在属、种的划分，系统与演化研究等方面取得了突破性进展。阐明了柽柳属植物的分布格局与环境的关系，首次利用RAPD分子标记的方法分析了刚毛柽柳9个居群遗传变异式样及空间分布格局，提出基因流的隔离是造成遗传分化的驱动力。
建成了世界上第一个柽柳科植物种质资源库，是世界上收集柽柳科植物种数最多的专类园；首次构建了白花柽柳的抑制性消减杂交文库；成功克隆出三个具有独立自主知识产权的抗旱基因。首次基于柽柳科植物的分布、基因交流能力、开发利用强度等，分析了柽柳科植物生物多样性损失的动因，提出了科学可行的柽柳科植物保护策略。项目为新疆生态环境建设提供柽柳苗木及柽柳栽培育苗技术服务，产生了良好的经济和社会效益。该成果对柽柳科植物生物多样性保护、可持续利用、干旱区退化生态系统恢复与重建及科学管理具有重要的理论价值和实践意义。研究思路与方法对干旱区其他植物资源研究与保护利用具有很好的借鉴作用。

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