全基因组测序解密慢性高原病(什么是基因组测序)

8月16日，由加州大学圣地亚哥分校、华大基因等单位共同完成的安第斯高地人慢性高原病全基因组测序及相关研究，在《美国人类遗传学杂志》上发表。研究为探索高原适应性的遗传机制提供了基础理论，也为慢性高山病的机理研究及治疗提供了科学依据。

全球约有1.4亿人世居高原。对于高原低氧环境的不适，通常会产生各种高原疾病，尤其生活在海拔3000米以上的人，通常会发生慢性高原病，表现为红细胞增多，并出现一系列头痛、乏力、嗜睡等症状。

研究人员对20个生活在高原地区的安第斯人进行全基因组测序，其中包括10个慢性高原病患者和10个正常人。研究人员发现其基因组中，有11个区域存在明显的单体型频率差异并发生选择性清除，暗示着这些区域受到强烈的正向自然选择。在位于这些区域的基因中，相比于正常人群，在慢性高原病患者中anp32d和senp1两个基因显著高表达。同时还发现，当果蝇中anp32d和senp1的同源基因表达下调时，其在低氧环境下的存活率将显著升高。据此，他们推测，这些基因表达下调可能有利于对低氧环境下的适应和耐受。

研究人员发现，慢性高原病患者负责调节红细胞生成的基因senp1表达上调，可能在导致慢性高原病患者红细胞增多的症状中扮演了重要角色。此外，anp32d是已知的原癌基因，研究人员推测在慢性高山病患者中，该基因以用类似于在癌细胞中的方式来改变细胞代谢，从而使得低氧环境下细胞大量增殖。这些发现同时还将有助于揭示类似环境下发生的疾病病理机制，如心脏病、阻塞性睡眠呼吸暂停综合征等。

科学家表示，通过强大的全基因组测序技术、体外培养的人细胞模型和果蝇活体模型的有机结合，不仅能够鉴定出与缺氧耐受相关的基因，同时也对这些基因的功能进行了系统的评估。这种研究策略将可用于发现更多疾病的致病基因。

什么是基因组测序

基因组测序是一种新型基因检测技术，能够从血液或唾液中分析测定基因全序列，预测罹患多种疾病的可能性，个体的行为特征及行为合理。基因测序技术能锁定个人病变基因，提前预防和治疗。基因测序相关产品和技术已由实验室研究演变到临床使用，可以说基因测序技术，是下一个改变世界的技术。

为何处于高原环境中，有的人会有高原反应？

人处于高原中，之所以有些人会有高原反应而有些人又没有高原反应是和人的上山速度、海拔高度、居住时间以及人体的基因等有关。

例如：根据科学研究表明，在藏族人中有一种基因是变异的，这种基因叫MTHFR，MTHFR变异后会提高藏族人体内的叶酸含量使其更能适应高原的生活环境。高原适应本来就有一个复杂的生物学过程，参与的基因应该很多，此次发现的基因变异只是其中发现的一小部分。

那作为在平原生活的人要怎样来面对高原反应呢？我们可以从高原反应的症状和适应性训练两方面来入手。

一、高原反应高原反应是指人体快速进入海拔3000米以上的高原，在低压低氧环境下出现的各种不适，是高原地区特有的常见病。

主要症状为头痛，失眠，食欲不振，疲劳，呼吸困难等。其中头疼是高原反应最常见的症状，症状通常是额部和双颞部跳动痛，在晚上或早上起床时疼痛会加剧。但通过调整呼吸或者轻微的运动等可以减轻头痛。

高原反应可分为急性和慢性。无论是急性高原反应还是慢性高原反应，最好的应对方法就是休息，减少机体的氧耗，同时注意保暖，防晒，防风等。

二、避免高原反应的适应性训练要避免高原反应需进行心理、体质适应性锻炼，使身体能对从平原到高原缺氧环境的转变过来。在避免高原反应的方法中，除对缺氧特别敏感者外，阶梯式上山是预防急性高原病最安全、最可靠的方法。

如果想要进入海拔4000 m以上的高原，进行适应性训练时应在2500~3000m处停留2~3天，然后每天上升的速度不宜超过600~900m。

除此之外，抵达高原后的前两天避免饮酒和服用不合适的药物，避免剧烈的体力活动，轻度的活动可以促使身体尽快的适应高原反应，同时要注意防寒防冻，注意保温，多吃高碳水化合物食物。

新一代测序技术

第一代测序技术以“Sanger法”为代表，实现了测序技术从无到有的飞跃，人们借助其完成了“人类基因组草图”，以及动植物、微生物等模式生物的基因组测序。一代测序经发展实现了自动化，但总体而言通量低、流程长、成本高，难以商业化。新测序技术以不可抵挡的势头发展起来。

新一代测序技术（next-generation sequencing, NGS）的起点是2005年以来Roche 454、Illumina GA/HiSeq、Life SOLiD/Ion Torrent、PacBio RS技术的发明，新技术使测序通量快速增加，测序成本极大降低。本文主要介绍Illumina测序技术、Pacific BioSciences SMRT RS测序技术、Oxford纳米孔测序技术及华大平台的DNBSEQ TM 测序技术。

该技术是目前应用最广泛的新一代基因组测序平台，它使用边合成边测序技术实现大规模平行测序。它最早是由Solexa公司开发，所以也称为Solexa测序技术。Illumina测序平台有多种仪器选择，如超大通量、适合测序中心和测序公司的 HiSeq 系列测序仪，也有适合中小型实验室测序和医院医疗诊断测序使用的 MiSeq 和 NextSeq500 测序仪，也有专门用于医疗诊断测序用的 MiniSeq 等。测序模式分为 高通量模式 与 快速模式 。其中，高通量模式可兼容更多的样本量及应用种类；而快速模式测序速度更快、单次运行成本更低。

Solexa测序技术的原理网友“星空Idealist”在“知乎”、“Z_Y_H”在“”等平台做过详细介绍：

（ 第二代测序原理的详细解析！- 星空Idealist的文章 - 知乎）；

（ illumina 双端测序- Z_Y_H的文章 - ）。

下面只做简单概括。该方法的第一步是 建立测序文库 （sequencing library preparation）（图1）。基因组打碎成小片段，双端补齐，3’加A尾，添加Illumina专用接头（一端有oligo T），该接头含有一个酶切位点，且为环状非互补链，故形成一个“球形”接头。当用限制酶进行切割后，形成“Y形”末端，从而能按部就班逐链复制。在双链末端加入与后续扩增引物互补的片段（通过两次复制实现，所加两端引物序列不同，设为P5、P7），以及在引物内侧加入标记（barcode）（所加两端标记不同），如有需要可用 Taq 酶补齐至平末端。做好以上工作，需行纯化，仅将正确添加接头的序列用于后续反应，去除引物、酶等杂质。以上操作可一次性对整个文库进行。

提纯后进行文库的 扩增成簇过程 （cluster generation），该过程的目的是为使测序信号放大。经变性的测序文库在有八个泳道（lane）的芯片（flow cell）上，与固化在泳道玻片壁上的寡核苷酸特异性互补结合（P5’、P7’），经一轮复制（5’->3’），模板被切断并洗掉，固定在芯片的寡核苷酸合成为互补链。然后开始桥式扩增（bridge amplification）把带有待测DNA片段的文库扩增到1000个拷贝左右，每个拷贝都有相同的DNA序列，这样就形成了簇（cluster）。最后一次扩增产物变性为单链，这些单链可用来双端测序（paired-end sequencing），但通常的做法是利用甲酰胺基嘧啶糖苷酶（Fpg）的8-氧鸟嘌呤糖苷（8-oxo-G）选择性切断作用，选择性将正向或反向序列从接头处切去，避免因链间距过近对序列添加的影响。若先切去反向序列，则测完后，再重复前述反应至选择性切割时，切去正向序列，进行反向测序即可。

第三步是 测序过程 。Illumina平台使用SBS技术和3’端可逆屏蔽终结子技术（3’-blocked reversible terminator）进行测序。3’端可逆屏蔽终结子技术利用有荧光标记的特殊核苷酸，这种核苷酸的3’羟基被化学基团屏蔽，导致每次DNA链合成都只能加入一个核苷酸，但当荧光图像记录完后，该化学屏蔽基团便通过酶切方法切掉，3’端恢复连接能力，如此周而复始。可以想象，由于起初变性文库中包含模板-互补链（二者的标记没有区别），在一次过程中同时被测序，因此在收集单向测序（single read sequencing）结果时需进行互补链识别，以免序列拼接发生混乱。正反双端测序，极大提高了测序效率。

由于Illumina测序技术使用扩增成簇的信号放大原理，使其读长无法达到一代测序水平，因为当扩增至数百碱基后，受核苷酸浓度、酶活等影响，簇内碱基添加将不再同步，不同步则信号混乱，导致读序不准。

该技术是Pacific BioSciences推出的 单分子实时（single molecular real time）DNA测序技术 ，基于边合成边测序原理。该技术主要特点是读长长，平均序列在10kb以上，最长读长可达40kb。它以SMRT Cell为测序载体，SMRT Cell是一张厚度为100nm的金属片，一面带有15万个（2014年）直径为几十纳米的小孔，称为 零模波导 （zero-mode waveguide, ZMW），也称纳米孔。测序时，系统将测序文库、DNA聚合酶和带有不同荧光标记的dDNA放置到纳米孔底部进行DNA合成反应。通常一个纳米孔固定一个DNA聚合酶Fenix和一条DNA模板。

该方法的特别之处在于 测序文库不需要扩增 ，因为零模波导能极大消除噪音荧光背景，而使单分子反应释放的荧光也能被准确记录。此外，SMRT技术用于检测标记的荧光基团与脱氧核苷酸的结合位置不是在碱基上，而是在5’磷酸基团的第3个磷酸基上，这样在dNTP于测序模板互补结合到测序引物上发生缩合反应后，荧光基团就随焦磷酸一起被切掉了，省去酶切步骤。

2014年Oxford Nanopore公司推出了几款基于纳米孔测序技术的测序仪MinION、PromenthION、GridION。其基本原理为：在充满了电解液的纳米级小孔两端加上一定的电压，可以很容易地测量通过此纳米孔的电流强度。纳米孔的直径只能容纳一个核苷酸通过，当核苷酸通过时，纳米孔被核苷酸阻断，通过的电流强度随之变弱。由于四种核苷酸碱基的空间构象不同，它们在通过纳米孔时，被减弱的电流强度变化程度也就有所不同。因此，只需检测DNA通过纳米孔时检测电流强度的变化，即可实现实时测序。

该法亦无需文库扩增，读长长，实时，单分子，可以极大降低测序成本。

该技术起源于Complete Genomics，改进于华大。下面根据华大官网文章简要说明该方法的原理。

按照图2的流程，华大基因使用DNA纳米球技术来扩增DNA序列，在该技术中，DNA被分割成约100碱基对的片段。该片段的每一侧与第一种接头，即接头1连接。连接后的DNA片段被扩增，通过将两端的接头结合而形成环状连接的序列片段。该环状DNA片段被切割以加入第二种衔接子，即接头2，并重复扩增和环化过程。一旦将四种接头，即接头1,2,3和4（四种接头的序列不同，有些是与引物互补的寡核苷酸，有些是标记物等）加入到DNA片段中，则通过滚环扩增最后的环状DNA以产生 DNA纳米球 （DNA nanoball, DNB）。滚球扩增时不切断各拷贝，而利用某种方法使扩增后变性但又不影响延伸，得到一团多拷贝的纳米球。将纳米球固定在芯片上的网状小孔内。

测序使用联合探针锚定聚合技术（combinatorial probe-anchor ligation sequencing, cPAS）和多重置换扩增的双末端测序法（MDA-PE）增加测序读长，可测得100bp/150bp的双端序列。目前为止，并没有对联合探针锚定聚合技术的详细披露。 MDA-P的具体原理是：经复制延伸完成第一链（Forward Strand）的测序后，在具备链置换功能的高保真聚合酶的作用下，除去第一链模板同时合成第二链（Reverse Strand），并通过DNA分子锚，进行第二链的测序。

与其他二代测序相比，DNBSEQ TM 测序技术基于DNB，DNB以最初模板扩增，不同于PCR的指数增长，最重要的是 其不会使扩增过程中产生的错误累积 。

[1] 陈浩峰. 新一代基因组测序技术[M]. 第一版. 北京: 科学出版社, 2016.
[2]第二代测序原理的详细解析！- 星空Idealist的文章 - 知乎.
[3]illumina 双端测序- Z_Y_H的文章 - .
[4]华大科技-产品服务-全外显子测序-产品介绍 .
[5]解密人类基因组：下一代测序 -（一）- Jing Zhou的文章 - LEXOLOGY.

华大基因的技术是多元技术领域,包括()技术。

华大基因的技术是多元技术领域，包括智能、生命科学、计算机科学、数学等技术。

华大基因是一个专门从事生命科学的科技前沿机构。以学、研、用为主的科研方式，涉及人类、医学、农业、畜牧、濒危动物保护等分子遗传层面的科技研究。

其业务主要包括：（1）构建生物技术与信息技术相融合的网络体系；（2）测序涉及生物学各领域，包括DNA测序、RNA测序、宏基因组测序、甲基化测序、外显子捕获测序、ChIP-Seq、MeDIP测序等。（3）以实现超大规模生物信息学计算为中心任务，不断提升其在高效能计算、云计算服务能力，为海量数据处理提供创新解决方案。华大基因向来不按套路出牌。

看似有些疯狂的举动，实际是华大基因建立技术优势的精心布局。华大基因的服务规模和测序团队是全球最大的，但在测序技术平台上需购买大批设备和耗材。收购CG实现了资金技术的互补，也使技术优势成为打破原有国际基因市场格局的反击武器。

通常由于科学技术实现产业化的过程周期很长，但在生物科技领域，尤其是在21世纪以后，生命科学由原来经典的实验科学、作坊式的实验科学变成了工厂式大数据的大科学。这种大科学利用数据分析处理，大大缩短了从科学发现到产业化的过程，使得一家机构同时进行产学研一体化成为了可能1990年由美、英、日、德、法及中国六国。

科学家启动的“国际人类基因组计划”，用10年时间、耗费30亿美元才完成了一个人的基因组测序。2007年华大基因只用半年，不到3000万人民币就完成了“第一个中国人基因图谱”。省时、高效的基因测序得益于华大基因在大数据背景下开创的新型基因科研模式，华大基因打造了具有全球竞争力的综合性大平台。

在强大“平台体系”驱动下，围绕生命中心法则，建起了测序、质谱、生物计算和国家基因库综合技术平台。

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