Cell新突破：基因“暗物质”的另一层功能(有没有关于基因敲除的论文啊)

Cell新突破：基因“暗物质”的另一层功能

2016年10月07日讯 约翰霍普金斯大学的研究人员通过解析一种罕见复杂的多基因疾病：Hirschsprung症，发现了更深层次的遗传机制，即这种疾病的患者是由于体内某个特殊基因的基因调控序列发生了多个突变，也就是说这些突变破坏了整个基因网络的协同功能。

这一研究成果公布在9月29日Cell杂志在线版上。领导这一研究的是约翰霍普金斯大学McKusick-Nathans遗传医学研究所教授Aravinda Chakravarti，他开创了所谓多基因复杂疾病研究的先河。

Chakravarti表示，“我们认为基因都是各过各的，但实际上它们不可能是单独存活。相反大家族中多个基因与调控元件都生活在同一条染色体上，不断的发生相互作用，每一个都有其自己的工作，但是都需要协同作用，完成一项基因功能，如果其中一个受到干扰，其它的也无法置身事外。”

Chakravarti很早就开始研究Hirschsprung症，这是一种先天性的紊乱，由于部分结肠缺乏神经细胞，因此无法放松，导致的结果就慢性便秘，腹部膨胀，在美国每5000个新生儿中就有一个受这种紊乱影响，但可以通过外科手术来治疗。虽然这种疾病有复杂的遗传成因，但它只有一个器官：结肠出现症状，因此是研究复杂遗传疾病的优秀模型。

在2002年和2015年，Chakravarti研究组分别通过全基因组关联研究 （GWAS） ，找到了与这一疾病相关的遗传突变，进一步的研究还确定了RET基因及其调控元件的重要影响--几乎每位Hirschsprung症患者都至少有一个RET相关突变。但是由于许多非Hirschsprung症患者也有这个突变，因此病理原因仍然是一个谜。

研究组成员决定试试分析 RET 基因附近特殊区域中的遗传代码SNP，这些所谓的基因增强子就像是开关，能通过结合合适的定位蛋白（转录因子），开启或关闭基因活性。

之后研究人员将RET基因换成了一个报告基因，在人类神经细胞系中进行了一系列的实验，发现只有三个SNPs在不同的增强子作用下，才能弱化增强子上结合转录因子的作用，减少基因活性。

研究人员检验了这三个SNPs的不同组合，结果表明虽然没有一个增强子能直接相互作用，但他们总结出了一个趋势：越多增强子受到影响，报告基因活性就越低。在这之后，研究人员又将实验扩展到了346位Hirschsprung症患者，和732位健康对照，从而确定了这一规律。出现这三个SNPs的人群具有Hirschsprung症四倍的患病风险。

进一步的小鼠实验中，研究人员发现这三个增强子是在发育胚胎肠道的不同发育时期发挥作用的，他们也找到了与其结合的转录因子。由此研究人员在小鼠中剔除了RET基因，检测其“基因家族”如何做出回应。结果三个与增强子结合的转录因子中有两个，在RET被沉默后活性降低，但在细胞表面与RET共同作用的蛋白，以及与RET结合的信号分子活性增加了，这些来自人体细胞的数据也表明降低转录因子的水平会减少RET的表达水平。

文章的第一作者Sumantra Chatterjee博士指出，“这一发现有助于解释RET相关的突变为何是Hirschsprung症的必需非充要条件。”

Chakravarti说，“我们证明了这些基因彼此关系密切，这不是因为它们序列或基因组位置相似，而是因为它们共同作用，执行一项功能。”

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基因敲除在肾素-血管紧张素系统研究中的应用
关键词： 基因 肾素-血管紧张素系统 高血压

肾素-血管紧张素系统（RASA）在维持正常血压和电解质平衡中起着十分重要的作用[1]，也是高血压防治研究的中心环节[2]。80年代以来对RAS的研究已深入到基因和分子水平，如RAS基因多态性与高血压发病的研究等[3]。近年来应用基因打靶（gene targeting）则为 RAS研究提供了一个全新的手段，本文着重介绍其中的基因敲除（gene kockout）在这方面的应用。
1基因敲除的基本原理和步骤
1.1 基本原理
基因敲除是利用基因同源重组（gene homologous recombination）又称基因打靶的原理，用外源片断整合到活体细胞DNA的同源序列中，使某个基因被取代或破坏而失活，由于同源重组具有高度特异性和方向性，外源片断也具有可操作性，故该技术可使细胞的基因定点和定量改变[4,5]。
1.2 基本步骤
为了改变某个动物的基因型且能稳定遗传，科学家们经过长期探索建立了将胚胎干细胞（embryo stem cell ESC）基因打靶及胚胎移植结合起来的一套新技术[6，7]。ESC取自小鼠胚泡的内细胞层细胞，具有能在体外培养保存又能在一定条件下发育成个体的性能。在体外进行基因操作后植回小鼠胚泡发育成嵌合体。嵌合体是含有突变基因的性腺细胞，通过杂交便获得突变基因的纯合子和杂合子。基因敲除过程：先克隆ESC靶基因的同源片断。用限制性内切酶切开其外显子两端，插入一个标志/选择基因（常用Neo-新霉磷酸转移酶基因，作为阳性选择基因和阳性同源重组的标志），另在载体同源序列外围接上另一个阴性选择基因（常用单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因，作为非同源重组的标志和筛选基因）。将载体导入ESC，用含G418/GANC的培养液作正负选择系统PNS）筛选出已发生同源重组的ESC，将后者植入另一怀孕小鼠的胚泡后发育娩出嵌合体小鼠。用Southem杂交来鉴定已携带敲除基因（即含Neo基因）的雄鼠，再用后者与同系雌鼠交配娩出基因敲除的杂合子即F1，F1近交便产生基因敲除的纯合子和杂合子（F2），经多次交配繁殖出数量众多的新品系小鼠且保持基因性状稳定遗传和供研究之用。
2 RAS基因敲除近况
rAS基因敲除只是近几年才出现的方法，但它极大促进了人们对RAS的认识。
2.1 血管紧张原基因敲除
tanimotok等[8]用基因敲除术建立了血管紧张素原（Agt）基因失活的纯合子和杂合子小鼠，并进行了一系列的研究，15个杂合子有4个幼鼠死亡，但成年鼠与纯合子和野生型小鼠的行为和主要脏器解剖学均无差异。纯合子血浆Agt和血管紧张素Ⅰ（AngⅠ）为阴性，杂合子为野生型42%，但纯合子肾组织mRNA表达增高6～8倍。与此同时纯合子鼠血压与野生型和杂合子相比，SBP、DBP和MAP分别下降33.5mmHg、14.3mmHg、20.8mmHg，而杂合子与野生型鼠的血压并无差别。为进一步研究Agt基因与血压之间的关系，Smithies等[9]通过精心设计的基因打靶（gap-repair gene targeting）培养出含不同野生型 Agt基因拷贝数量的小鼠（分别含有0～4个拷贝）。结果Agt基因缺失型小鼠、幼鼠大部分死亡，少数成活的成年鼠却有肾小球小动脉壁增厚，肾皮质变薄和肾小球萎缩，但繁殖力正常。含1～4个Agt基因小鼠生长发育及肾组织结构正常无异，最明显的变化是随着基因拷贝增多，血中Agt水平几乎呈线性水平增高，从35%（单拷贝）到124%（3拷贝）和145%（4拷贝），同时血压升高程度达到8mmHg/每拷贝，该模型说明了Agt基因与血压水平之间的数量依存关系。最近该作者又将转基因技术与基因打靶结合起来，将含人肾素和Agt基因的小鼠与Agt缺失型小鼠交配，使后者重新携带人肾素及Agt基因，结果纠正了纯合子的低生存率及肾病变，同时血压升至正常。该模型表明，Agt对小鼠特别是肾的生长发育非常重要，且人类Agt基因也能取代小鼠Agt基因的功能[10,11]。
2.2 血管紧张素Ⅱ受体基因敲除
血管紧张素Ⅱ（AgtⅡ）受体目前分为Ⅰ型（AT1）和Ⅱ型（AT2），AgtⅡ主要通过AT1起作用。AT1又可细分为AT1a和 aT1b两个亚型，它们高度同源但组织分布不同，由于缺乏有效的方法来分别两者生理分工[12]，Masaki等[13]用基因敲除培养出缺乏AT1a受体基因小鼠纯合子和杂合子与野生型相比，两种基因型小鼠的生长发育及心、脑、肾、血管组织结构正常，肾组织Ang-AT1受体结合为阴性，杂合子为野生型50%，杂合子及纯合子基础血压分别比野生型降低了12mmHg和24mmHg。他们还观察到几种基因型对 angⅡ反应，纯合子几无反应，杂合子升压幅度低且血压回降速度快，结果证明AT1a是AngⅡ调控血压所必需的。Taskeshi等[14]建立的小鼠已证实了上述结论，且发现纯合子肾组织mRNA和血中肾素水平明显升高，他们还进一步研究了该模型小鼠肾小球AT1a分布及对AngⅡ（激动剂）和CV-11974（拮抗剂）作用，证实 aT1a分布主要入球、出球小动脉和系膜细胞，AngⅡ主要通过AT1a起作用[15]。Lutz等[16]培养出AT2受体基因缺失型杂合子和纯合子小鼠，两者幼鼠成活率相同，重要脏器结构均正常，基础血压也无改变，仅纯合子小鼠对AngⅡ反应超常及对脱水试验反应迟钝，主动活动减少，作者认为AT2对生长发育并不重要但参与RAS系统的心血管功能和中枢神经系统功能的调节。但Lchiki等[17]建立的同样模型却发现突变型小鼠基础血压比野生型高，作者还进行了系列药理试验，给野生型和缺失型小鼠以AngⅡ、losartan、captopril，结果AngⅡ升压作用在缺失型强于野生型，lostartan降压作用也是如此，但 captopril效果两组之间相同，作者认为在AT2功能上有直接对抗AT1作用。对于两种AT2基因缺失型小鼠血压变化不同的现象，Lutz认为与小鼠品种稍有不同而遗传背景相差有关。
2.3 ACE基因敲除
业已证明，ACE基因编码体细胞型和睾丸型两种同功酶，但后者功能仍不清楚，为了研究它们在血压调控和生育调控方面的作用，Krege等[18]用插入法敲除了ACE基因中对两种ACE编码必需的第14个外显子。结果表明杂合子和纯合子幼鼠成活率降低，雌鼠繁殖能力正常而雄鼠下降，两种基因型鼠肾脏发生退行性改变，值得注意的是尽管雌雄鼠两种纯合子和杂合子血ACE活性减低，但仅雄鼠的血压下降15～20mmHg。作者认为，ACE对肾脏发育是必需的，在调节血压方面存在性别差异，人类是否有这种情况需进一步研究[19]。此后该作者又用所谓双基因打靶术（double gene targeting）培养出含1、2、3、4个功能性ACE基因的小鼠，结果随着基因数量增加，心脏重量亦增加，肾脏mRNA表达增强，但血压始终末见有差别。作者认为，ACE活性变化只有足以超过体内平衡机制方会导致血压改变[20]。最近Charles等[21]用基因敲除培养出ACE基因突变小鼠。后者ACE基因不能编码含羧基末端氨基酸残基的ACE肽链。结果小鼠血浆ACE活性虽然很高，但组织细胞中却未测到ACE结合。同时伴低血压、肾脏病变和尿浓缩功能损害，其表型与完全缺乏ACE基因小鼠相同，证明ACE羟基末端含有膜结合点，如果缺乏则ACE只能全部释放出细胞而不能发挥对组织结合和调节功能。
2．4 肾素基因敲除
肾素是RAS中的限速酶，Mattew等[22]建立了缺失肾素基因-2（Ren-2）的小鼠，结果小鼠外观和组织学检查均未见异常，血压亦无变化，只是血浆肾素活性高于野生型。但该小鼠是含两个肾素基因（Ren-1和Ren-2）的为数不多的动物之一，作者认为正常机体发挥作用主要靠Ren-1基因。
3 展望
利用同源重组技术建立新的动物模型是分子生物学和遗传学中具有里程碑意义的突破。人们可以在此基础上更多、更快、更准确地培养出基因缺失、基因突变、转基因动物对基因表达及调控和其功能进行细致的研究。过去由于方法限制，对高血压相关基因研究难于突破，而利用该项技术可以定点定量研究有关基因对心血管结构和功能的影响，从而为研究高血压的发病机制和防治开辟了广阔深入的途径。
参考文献
1 kathy K et al.Circulation,1993；87:1816～828
2 laragh JH.Kidney int,1993；44:1163～1175
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5 Becker KD et al.Hypertension,1996;27:499～501
6 evans MJ.Nature,1981;292:154～156
7 te Riele H et al.Proc Natl Acad Sci USA,1992；89:5138～5132
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9 smithies O et al.Proc Natl Acad Sci USA,1995;91:3612～3615
10 Robin d et al.J Clin Invest,1997;99:1258～1264
11 Kim hS et al.Proc Natl Acad Sci USA,1995;92:2735～2739
12 Theodoree O et al.N Engl J Med,1996;334:1649～1655
13 Masaki I et al.Proc Natl Acad Sci USA,1995;92:3521～3525
14 Taskeshi S et al.J Biol Chem,1995;270(32):18719～18722
15 Kenjiro K et al.Kidney Int,1997;52:S201～S204
16 Lutz h et al.Nature,1995;377(26):744～747
17 Lchiki T et al.Nature,1995;377:748～750
18 Krege jH et al.Nature,1995;375;146～148
19 Hilgers KF et al.Hypertension,1997;29:216～221
20 Krege jH et al.Hypertension,1997;29:150～157
21 Charles R E et al.J Clin Invest,1997;99:2375～2385
22 Mattew GF et al.Hypertension,1996;28:1126～1131

Nature | 肿瘤治疗新突破点——类先天性杀伤型T细胞

肿瘤免疫监视的概念归因于细胞免疫在消除转化细胞方面的作用。传统的CD8+细胞毒性T细胞是这种作用的主要中介，但它们也会转变为功能失调的衰竭状态，其特征是表达抑制性受体，如程序性死亡-1 (PD-1)。尽管抗PD-1治疗在恢复癌症免疫方面取得了临床成功，但也有许多患者对这种治疗没有反应，因此有必要研究癌症免疫监测的替代机制。

4月20日，美国纪念斯隆凯特琳癌症中心（Memorial Sloan-Kettering Cancer Center）的李明教授及其研究团队在Nature上发表了题为“Programme of self-reactive innate-like T cell-mediated cancer immunity”的研究， 揭示了在肿瘤组织内新发现的一种具有强大抗肿瘤能力的新型免疫细胞，为无法受惠于现行免疫疗法的癌症病患提供了新希望。

在对小鼠和人类恶性肿瘤T细胞的研究中，研究者发现了一类αβ T细胞受体(TCR)阳性，表达FCER1G，具有高细胞毒性潜能的 类先天性杀伤型T细胞(ILTCKs)。 这些细胞能够识别未突变的自身抗原，产生于早期遇到同源抗原后的不同胸腺祖细胞，并在肿瘤进展期间不断地由胸腺祖细胞补充。值得注意的是，肿瘤内ILTCKs的扩张和效应分化依赖于癌细胞中白细胞介素-15 (IL-15)的表达，在ILTCK前体细胞中IL-15信号的诱导激活抑制了肿瘤的生长。因此，抗原受体的自我反应性、独特的个体发生和独特的癌细胞感应机制将ILTCKs与传统的细胞毒性T细胞区分开来，并定义了一类新的肿瘤引发的免疫反应。

ILTCKs具有独特的转录组

为了研究肿瘤浸润T细胞之间的异质性，对MMTV-PyMT (PyMT)小鼠乳腺肿瘤组织中的CD45+TCRβ+CD8α+细胞进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析，结果显示有五个不同的簇。PyMT小鼠肿瘤浸润CD8α+ T细胞表现出不同的分化和增殖状态，其中簇3（C3）代表最新鉴定的αβ TCR家族ILTCKs (αβILTCKs)。分化轨迹推断表明αβILTCKs分化程序代表了一种进化保守的肿瘤引发的免疫反应。

ILTCKs TCRs能够识别未突变的肿瘤抗原

NK1.1+ CD8α+?αβILTCKs细胞与传统的PD-1+ CD8α+ T细胞不是同一个来源。与PD-1+ T细胞相比，NK1.1+?αβILTCKs细胞来源的TCR能够识别来自多个小鼠的癌细胞共有的未突变抗原。但在缺乏MHC-I（主要组织相容性复合体）分子的癌细胞中，这种抗原反应也随之消失。αβILTCKs细胞的TCR能够识别特定的肽- MHC-I复合体，而不是MHC-I分子本身。

ILTCKs的选择具有竞争性

传统的CD8+ T细胞应答需要依赖于BATF3和IRF8的传统1型树突状细胞(cDC1s)的启动，而肿瘤内NK1.1+?αβILTCKs应答不依赖于cDC1s。这些发现表明，在次级淋巴器官中，αβILTCKs独立于树突状细胞介导的启动，并与传统的CD8+ T细胞不同。事实上，在肿瘤中，发展表达αβILTCKs来源TCR的胸腺细胞始终和特异地生成NK1.1+?αβILTCKs，而不是PD-1+ T细胞。因此，NK1.1+?αβILTCKs和PD-1+ T细胞代表了两种相互排斥的细胞命运选择。强烈的自身反应性驱动αβILTCKs谱系定型，类似于指定不变自然杀伤T细胞(iNKT)和肠上皮内淋巴细胞(IEL)命运的“激动剂”选择过程。αβILTCKs的激动剂选择信号由对辐射敏感的造血细胞和抗辐射的基质细胞调控。

FCER1G的表达标志着ILTCKs谱系

为了进一步了解ILTCKs谱系的特异性，比较了肿瘤浸润NK1.1+?αβILTCKs和PD-1+ T细胞及其各自胸腺祖细胞的基因表达谱。编码NK受体和信号分子的基因在αβILTCKs前体细胞中上调，并在成熟的NK1.1+?αβILTCKs中保持高表达。NK1.1标记激活的αβILTCKs，但可能不能识别肿瘤中所有的αβILTCKs细胞系。FCER1G则是一个保守的αβILTCKs谱系定义标记，FCER1G的表达充分识别了浸润肿瘤的αβILTCKs，且不考虑其是否是激活状态。

ILTCKs可用于癌症治疗

NK1.1+?αβILTCKs严重依赖促炎细胞因子IL-15，在缺乏IL-15的小鼠中几乎完全没有FCER1G+胸腺αβILTCKs祖细胞。由于IL-15在淋巴组织和非淋巴组织中均有表达，驱动肿瘤内αβILTCKs扩增和激活的IL-15的确切来源仍然未知。但是，ILTCKs感知癌细胞衍生的IL-15这一点可用于癌症免疫监视。αβILTCKs中的IL-15信号轴可以成为开发癌症疗法的强大且可利用的底物。

这项研究表明，早期遇到自身抗原可能会永久性地抑制αβILTCKs谱系中的TCR信号传导，但TCR在αβILTCKs中的后选择作用仍有待确定。研究强调了基于αβILTCKs的过继细胞转移疗法的优势，因为这种方法不需要特定靶抗原的认知。因此，针对ILTCKs的策略可能对具有低突变负担或对PD-1阻断方式无效的肿瘤特别有效。

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