Western,Blot一定要用看家蛋白做内参？NO！还可以是总蛋白

Western,Blot一定要用看家蛋白做内参？NO！还可以是总蛋白

2016年10月05日讯 期刊杂志对Western Blot文章发表的要求越来越严，这些要求包括如何确保Western Blot的重复性、定量的准确性、均一化方法的选择等。Nature、JCB、JBC等杂志明确规定Western Blot进行均一化时，要求选择不受实验条件影响的方法；JBC甚至还建议优先选择总蛋白进行均一化。今天基因小编就对Western Blot均一化方法做一简单总结与分析。

什么是均一化呢？

Western Blot均一化是指：将目标蛋白信号÷上样对照信号得到均一化的数据，以此来校正不同样本之间、不同泳道之间的差异，以获得准确、可重复的Western Blot的结果。上样对照一般是稳定表达的内参蛋白，表达量不受环境、实验处理的影响。

为什么要进行均一化呢？

均一化校正了样本之间的差异，保证了Western Blot检测到的数据是目标蛋白真实的数据。如果没有进行合适的均一化，不能确保获取的实验数据是真实的生物学差异还是实验导致的误差。

有哪些均一化方法呢？

比较经典的方法是用看家蛋白做内参进行均一化，看家蛋白又称管家蛋白，一般被认为在所有的组织中表达恒定且不受实验条件的影响，主要包括 Actin/Tubulin/GAPDH等，但是进一步的研究表明，在某些实验条件下，看家基因的表达会因不同类型的组织、不同的发育阶段、或不同的实验条件而变化。另外，用看家蛋白进行均一化需要注意信号饱和的问题，因为一般情况下看家基因表达丰度相对于目标蛋白丰度较高，两种蛋白可能存在不同的线性范围，为此实验人员往往需要调整上样量。因此为了确保更准确、客观的的均一化方法，有些研究人员、期刊杂志建议用总蛋白做Western Blot的均一化。

总蛋白染色---REVERT? Total Protein Stain

总蛋白均一化是利用染料对胶上/膜上的总蛋白染色进行均一化，主要包括以下几种类型：不可逆结合染料法：如考马斯亮蓝染色法、Stain Free法等；可逆结合染料法：REVERT? Total Protein Stain总蛋白染色法。考马斯亮蓝染色法操作简单但往往需要同时跑两块胶，一块胶进行染色另一块胶进行后续免疫试验，因为是对胶进行染色所以存在不能校正转印差异的问题；Stain Free等染料不可逆共价结合蛋白法，是对胶上或膜上总蛋白进行染色，由于与蛋白是共价不可逆结合，因此可能会影响抗体与靶蛋白的结合，并且在膜上的背景较高、线性范围也比较窄；LI-COR REVERT? Total Protein Stain方法是对膜上总蛋白进行染色，因为是可逆结合所以不会影响后续抗体结合，不干扰Western Blot的检测，而且是在近红外波段成像背景较低，灵敏度较高，因此能够校正Western Blot的所有步骤，适用于任何生物条件下的实验。

哪种均一化方法最好？

没有哪一种均一化方法是最好的，因此需要了解每一种方法的特点以便选择一种符合您实验目的、生物学条件的均一化方法，以校正不同样本之间的差异，带给您准确、可重复、可发表的高质量数据。无论您选用哪种均一化方法，LI-COR Odyssey 近红外激光成像系统都能提供准确的结果。

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什么蛋白可以做western blot，抗体如何选择

1、哺乳动物的组织或者细胞样本，通常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na,K atpase等。

2、植物来源实验样本，则可以选择plantactin、Rubisco等。

3、其他来源样本研究较少，所以就应该参照文献报导，选择合适的蛋白作为内参。

western blot等生物学试验中的内参是什么意思

　　内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物(mammal;mammalian)细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。
　　在Western Blotting 实验中，内参在样品中的含量检测结果，能够用于校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，从而保证实验结果的准确性。

western blot 的内参不一致，急求助

要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker（用来确定蛋白条带对应的分子量大小）、空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照）、已知量标准产物的正对照，另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果，即便有结果也可能影响结果的分析。
内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。

实际上内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础，特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析，所以需要内参。在国外发表的文章中，Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在Western Blotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。
然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的蛋白浓度。如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质如DNA的干扰，且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA、Bradford、Lowry 等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford法敏感度最高，且与一系列干扰Lowry、BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容，但是对去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在Western blotting实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。
在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。

在Western Blotting实验过程中使用内参的方法通常有一下三种。第一种是超级简便的标记内参使用法，只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可；第二种是普通内参，当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测，然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。第三种，当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开，然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。

常用的蛋白质内参有GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。一般我们选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。因此你要知道你检测的蛋白的分子量来选择合适的内参！
actin即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin，其余两种广泛分布于各种组织中，包括beta-actin(β-non-muscle)和gamma-non-muscle actin。这些不同的亚型组织分布是不一样的，在肌肉组织中的beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的组织本来就应该选择不同的内参，不能一概而论的。beta-actin作为内参是得到了公认的，这是针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富。尽管最近有一些文章已经开始质疑beta-actin作为内参的有效性（好像是对于上样量>20ug的蛋白区分能力下降，记不清楚了），但是发文章应该还是没有问题的。至于其他的内参也是可以考虑用的，GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，而tubulin和actin类似，是细胞骨架的组成部分，但是不是肌肉的主要成分，应该是一个代替品。三种同时发生变化的情况很少，需要具体分析。一旦出现上述三种内参同时发生变化，如果是总蛋白可以用胞核的内参如PCNA，TATA-box bingding protein（TBP）甚至线粒体的内参来代替，当然一般这种可能性出现的几率微乎其微。

不同异构体表达对蛋白的检测是有很大的影响，买抗体前要好好熟悉自己的目的蛋白，很多抗体杂不出条带其实未必是抗体质量的问题。很多公司的内参抗体是用抗原片段制备的，不同的公司选择的片段不一样。以最常用的beta-actin为例，有的公司选择N-端，有的选择C－端。选用N-端Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys 16aa作为抗原制备抗体(单抗和多抗)的占大多数，主要有santa cruz(Cat# sc-69879),sigma(Cat# A1978等)，ProSci(Cat# 3779),Cell Signaling(Cat#4967)，Axxora PLATFORM(BET-A300)等，这类抗体均不能检测心肌和横纹肌中的actin条带。选用C-端16aa短肽作为抗原制备抗体的主要有Axxora PLATFORM(PSC-3777)，EPITOMICS(1784-1,1854-1等)，这类抗体可以在肌肉细胞中检测到actin阳性信号。有时候在实验中检测内参时产生“组织特异性”，就是由于抗体选择不对造成的。
actin几种异构体存在组织分布特异性，不同型actin之间具有较高的序列相似性(>90%)。β-actin是分布于非肌细胞中的一种骨架蛋白，选择作β-actin内参时首先得保证是组织广泛表达的（尤其是做蛋白的组织表达谱时）。那么制备β-actin抗体的抗原应该是选用与actin其它异构体一致的氨基酸序列。公司制备抗体是选用beta-actin的某一段小短肽作为免疫原，可能会因为选取的短肽在不同型actin之间保守与否,而导致所制备抗体具有一定的组织特异性.如选取的短肽仅在beta型存在,所得抗体就仅能检测非肌细胞中的actin,而选取的短肽在六型中均存在,则此抗体除非肌细胞外,还可以检测cardiac，skeletal，smooth muscle细胞的actin。

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