中科院科学家构建空间转录组测序新方法(10X空间转录组数据分析梳理)

中科院科学家构建空间转录组测序新方法

中科院生物化学与细胞生物学研究所景乃禾课题组新近创立了一种技术方法，可以获得具有空间位置信息的少量细胞转录组图谱。相关研究成果日前在线发表于《自然-实验室指南》。

无论是体内组织还是体外细胞系，不同细胞之间都存在着差异性，即细胞的异质性。细胞的异质性对解释肿瘤的发生、干细胞或前体细胞的多能性与谱系分化、干细胞与微环境的相互作用等具有重要意义。近些年，单细胞测序技术迅速发展，使得研究细胞之间的异质性成为可能。然而，目前单细胞测序的方法均会丢失细胞在体内原有的位置信息，而对某些研究领域如发育生物学、肿瘤生物学而言，细胞来源的位置信息是十分关键的。

在景乃禾和彭广敦的指导下，陈军通过整合与优化单细胞测序和激光显微切割技术，构建了一种能够获得少量细胞转录组信息，同时保留细胞原有位置信息的测序方法：Geo-seq。

Geo-seq是一种高效、高分辨率的空间转录组分析方案，既可用于转录图谱的三维重建，也可用于研究具有特殊结构的少量组织或细胞的转录组信息。利用Geo-seq技术，该课题组绘制了小鼠早期胚胎原肠运动中期精细的三维分子图谱，并揭示了小鼠细胞谱系蓝图建立过程中的空间转录组特征、转录因子和信号通路调控网络。

据悉，Geo-seq技术已成功应用于小鼠大脑发育、肝脏肿瘤学以及人的精子发育等研究中。

10X空间转录组数据分析梳理

空间转录组学 (ST) 技术正迅速成为单细胞 RNA 测序 (scRNAseq) 的延伸，具有以单细胞分辨率分析基因表达的潜力，同时保持组织内的细胞组成 。同时拥有表达谱和组织组织使研究人员能够更好地了解细胞相互作用和异质性，从而深入了解传统测序技术无法实现的复杂生物过程。 ST 技术生成的数据本质上是嘈杂的、高维的、稀疏的和多模态的（包括组织学图像、计数矩阵等），因此需要专门的计算工具来进行准确和稳健的分析 。然而，目前许多 ST 研究使用传统的 scRNAseq 工具，这些工具不足以分析复杂的 ST 数据集。另一方面， 许多现有的特定于 ST 的方法都是建立在传统的统计或机器学习框架之上的，由于空间分辨数据的规模、多模态和限制，这些方法在许多应用中都不是最优的（如空间分辨率、灵敏度和基因覆盖率）。鉴于这些复杂性，研究人员开发了基于深度学习 (DL) 的模型来缓解 ST 特有的挑战 。这些方法包括对齐、空间重建和空间聚类等新的最先进模型。然而，用于 ST 分析的深度学习模型是新生的，并且在很大程度上仍未得到充分探索。在这篇综述中，概述了用于分析空间分辨转录组学的现有最先进工具，同时更深入地研究了基于 DL 的方法。讨论了该领域的新前沿和未解决的问题，并强调了我们预计转型 DL 应用的领域。

尽管多细胞生物在其细胞内包含一个共同的基因组， 但细胞的形态和基因表达模式在很大程度上是不同的和动态的 。 这些差异源于内部基因调控系统和外部环境信号。 细胞在组织中增殖、分化和发挥作用，同时从周围环境发送和接收信号 。 这些环境因素导致细胞命运高度依赖于它所处的环境。 因此， 研究细胞在驻留组织中的行为对于了解细胞功能及其过去和未来的命运至关重要 。

单细胞测序的进步已经改变了基因组学和生物信息学领域。单细胞 RNA 测序 (scRNAseq) 的出现使研究人员能够分析各种组织和器官的基因表达水平，从而使他们能够创建不同物种的综合图谱 。此外，scRNAseq 能够检测组织内存在的不同亚群；这对于发现新的生物过程、疾病的内部运作和治疗的有效性至关重要。然而，实体组织的高通量测序需要组织解离，导致空间信息的丢失。为了充分了解细胞相互作用，需要组织形态和空间信息的数据，而单靠 scRNAseq 无法提供这些数据。 从发育阶段（例如母细胞和子细胞的不对称细胞命运）到细胞分化（例如细胞功能、对刺激的反应和组织稳态），细胞在组织内的放置至关重要。这些限制将通过可以在单细胞水平测量基因表达的同时保留空间信息的技术得到缓解 。

Spatial Transcriptomics (ST) provide an unbiased view of tissue organization crucial in understanding cell fate, delineating heterogeneity, and other applications 。然而，与 scRNAseq 相比，当前许多 ST 技术的灵敏度较低，同时缺乏 scRNAseq 提供的单细胞分辨率。靶向原位技术试图解决分辨率和灵敏度的问题，但在基因通量方面受到限制，并且通常需要对靶基因的先验知识。更具体地说，原位技术（例如原位测序、单分子荧光原位杂交（smFISH）、靶向扩增测序、环状衔尾蛇smFISH（osmFISH）、多重抗错荧光原位杂交（MERFISH）、序列 FISH (seqFISH+) 和空间分辨转录扩增子读数映射 (STARmap) 通常仅限于数百个数量级的预选基因，随着更多探针的添加，准确性可能会下降。 将参考这些方法称为基于图像的技术 。

另一方面，基于下一代测序 (NGS) 的技术（例如 10x Genomics 的 Visium 及其前身 Slide-Seq、HDST）对整个转录组进行条形码化，但捕获率有限，分辨率大于单个细胞（ Visium 为 50 μm - 100 μm，Slide-Seq 为 10 μm）。 此外， 与基于图像的技术不同，基于 NGS 的方法允许对大型组织切片进行无偏见的分析，而无需一组靶基因 。 然而，基于 NGS 的技术不具有单细胞分辨率，需要使用计算方法推断细胞特征或将其与组织学尺度相关联。 许多当前算法使用需要人工监督的传统统计或医学图像处理框架，这对于大规模分析来说并不理想。 此外， 许多算法无法在不同的测序平台上推广，这限制了它们的实用性并限制了多组学集成工作 。

深度学习 (DL) 方法可以使用原始数据来提取执行任务所需的有用表示（或信息），例如分类或检测 。这种质量使得此类机器学习 (ML) 算法非常适合可用数据量大、维数更高且嘈杂的应用，例如单细胞组学。 DL 模型已广泛用于 scRNAseq 研究（例如预处理、聚类、细胞类型识别和data augmentation），并且已显示出对传统方法的显着改进 10，表明此类方法在 ST 分析中的潜力。此外，DL 模型可以利用多个数据源（例如图像和文本数据）来学习一组任务。鉴于空间分辨的转录组学本质上是多模态的（即它们由图像和基因表达计数数据组成）并且下游分析由多个任务组成（例如聚类和细胞类型检测）， 研究人员一直在寻求开发 ST 特定的 DL 算法 。

随着现在定义的技术， 接下来描述用于分析 ST 数据的常见机器学习 (ML) 方法 。 首先讨论 ML 和深度学习 (DL) 模型的算法开发，然后讨论用于空间解析转录组学（和 scRNAseq 数据）的常见架构。

原始实验数据通常包含噪声或其他不需要的特征，这对 ML 算法提出了许多挑战 。因此，通常需要仔细预处理数据或依赖特定领域的专业知识，以便将原始数据转换为 ML 模型可以从中学习的某种内部表示。然而， 深度学习 (DL) 算法旨在仅使用原始数据来自动提取和构建学习手头任务所需的有用表示 。从广义上讲，DL 模型能够通过构建概念层次结构从观察中学习，其中每个概念都由其与更简单概念的关系来定义。概念（和学习）层次结构的图形表示将由许多层组成，许多节点和边连接顶点，有点类似于人类的神经网络。该图被称为 人工神经网络 (ANN) 。 ANN 由相互连接的节点（“人工神经元”）组成，这些节点类似于并模仿我们大脑的神经元功能。如果一个人工神经网络由许多层组成——通常超过三层，则它被认为是一个深度学习模型，因此被称为深度模型。

ST 领域正在迅速发展，每周都会发布新的数据集和分析管道。 生物方法的创新将继续激发算法开发的创造力，重点是基于 ML 的框架。 尽管目前用于 ST 分析的 DL 模型的空间很小，但预计该领域将经历向深度学习模型的范式转变 。

这里 概述了当前基于 DL 的技术，用于 ST 数据的对齐和整合、空间聚类、点反卷积、推断细胞间通信，以及使用 scRNAseq 数据（有限或没有空间参考）重建空间坐标的方法地图集） 。与传统方法相比，提出的 DL 方法具有准确性和可扩展性优势。然而，DL 方法并不总是首选，因为它们的计算成本很高，并且可能缺乏生物学可解释性。随着更多 ST 分析方法的开发，我们相信用于对新模型进行基准测试的标准数据集以及对现有技术的全面准确性和效率分析将对该领域具有重要价值。尽管现有方法在各自的类别中设置了新的最先进技术，但改进的空间仍然很大。在 ST 下游分析中，DL 算法在研究细胞间通讯和空间可变基因鉴定中的应用仍然大多未得到充分探索。鉴于 DL 模型能够从原始数据中提取复杂模式， 预计 DL 方法将在解开复杂的生物过程中证明是有用的，有助于在空间环境中识别细胞相互作用和高度可变的基因 。

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空间转录组如何圈出特定细胞

空间转录组是一种用于从空间层面上解析RNA-seq数据的技术,从而解析单个组织切片中的所有mRNA。空间条形码逆转录oligo(dT)引物在显微镜载玻片表面的有序附着,使得在mRNA样品处理和后续测序过程中位置信息的编码和获取成为可能。

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