Nat,Commun：干细胞基因或可控制骨骼肌再生

Nat,Commun：干细胞基因或可控制骨骼肌再生

2016年10月14日讯 我们都知道，Prox1基因在胚胎发育过程中扮演着重要的角色，日前，一项刊登在国际杂志Nature Communications上的研究报告中，来自芬兰的研究人员通过研究发现，Prox1基因或许对于骨骼肌干细胞的分化也非常关键。骨骼肌不仅对于运动非常重要，而且对于整个机体新陈代谢的调节也很关键，在机体损伤之后肌肉有着强大的能力进行再生，同时还能够不断适应运动训练。

此前研究中，研究人员通过研究发现，Prox1基因或许也有黑暗的一面，比如其在结直肠癌的发生过程中扮演着重要的作用。如今研究者发现，名为卫星细胞的骨骼肌干细胞同样能够表达Prox1基因，而且当该基因处于活化状态时卫星细胞能够分化为肌肉纤维。

研究者指出，我们在成年人的慢肌纤维中也能够发现Prox1基因的表达，机体中的慢肌纤维具有良好的耐力和高度的代谢活性，成人机体中大约有一半的骨骼肌都是慢肌纤维肌肉，研究者Kivela说道，在小鼠机体中，Prox1基因能够将快肌纤维转换为慢肌纤维，而剔除Prox1基因则会增加快肌纤维基因的活性。

最后研究者表示，本文研究阐明了Prox1基因在卫星细胞分化分化及慢肌纤维维护过程中扮演的重要角色，为后期深入研究人类肌肉和代谢疾病，比如2型糖尿病等疾病的发病机制提供了新的研究线索，研究者Kivela说道，在人类机体中，Prox1基因的多态性和2型糖尿病发病风险增加直接相关。

干细胞简介

干细胞（stem cell）是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。干细胞（Stem Cell）是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。

果蝇体节间细胞与体节内细胞的区别

　　两种细胞都属于体节细胞，分布部位不同，差别并不大
　　亦称隔膜、隔壁。是指两个以上体节的动物各体节间的隔膜。在发生上起源于中胚层，由体腔上皮和结缔组织构成。在原环虫每个体节间都很完整，但在寡毛类、多毛类等，则某些体节间无间隔。哺乳类的横隔膜、鸟类的斜隔膜也是体节间膜的特殊的例子。节肢动物体表各体节间以及四肢关节间所有的节间膜虽然也称体节间膜，但都与此不同。

心血管疾病基因治疗：借鉴失败，迈向成功

打败智力竞赛冠军后，机器人将取代医生？千兆基因组定序完成 癌症研究重大里程碑生物资讯共享：隐私风险谁把关？启动减肥基因 自由控制食欲开关 心血管疾病除了会严重危害患者生活品质并大幅增加国家医疗负担，其死亡率在各国也长期稳居十大死因的前三名。尽管外科手术、药物、以及监测工具日新月异，也能有效延长患者寿命，但已经受损的心脏或血管组织仍难以恢复至健康状态。即使心脏移植能拯救严重心脏衰竭病患，但一「心」实在难求，故寻找其他疗法实乃刻不容缓。这十几年来，基因操作技术的长足进步使得基因疗法被寄予厚望，不过目前为止尚未有明确进展。究竟过去为什么失败，未来该怎么发展？鉴往，或许有助于知来。

过去心血管疾病基因治疗临床试验所遭遇的挫折

自 2002 年的 AGENT 临床试验开始 [1] ，基因治疗尝试用于人类心血管疾病已经有十年以上的历史。试验结果多显示基因疗法无明显的安全性疑虑，但对于相关症状和指标却也没有显著改善。以 AGENT 试验为例，检测的疗法是为心血管疾病患者以导管注射纤维母细胞生长因子 4 互补 DNA (FGF-4 cDNA) 的腺病毒载体至冠状动脉，期望能加速新血管生成以恢复缺血心肌的血液及养分供应。尽管这项疗法顺利通过第一与第二期临床试验的安全性和初步疗效考验，但第三期之 AGENT-3 及 AGENT-4 试验 (2007 年) 却因治疗组与对照组在跑步机运动的表现无显著差异而被迫提前中止 [2]。

类似情况也发生在 CUPID 试验。肌浆网是肌肉的钙离子储存槽，受到神经电讯号 *** 就会将钙离子释出至肌细胞促其收缩，收缩过后则必须把钙离子收回肌浆网，肌肉才能放松以准备进行下次收缩。心脏衰竭有一部份的原因就是上述钙离子循环无法正常运作，故 CUPID 试验以腺病毒将肌浆网 Ca2+-ATP 酶 2a (SERCA2a) 送入心肌细胞，希望可以恢复健康的钙离子流动。但同样在经过第一期临床试验确保其安全性后，第二期的随机分派、双盲试验也因为主要评估指标 (治疗后到心脏衰竭住院并且发生死亡、心脏移植、植入左心室辅助器材、或步行能力下降的时间) 在治疗组和对照组之间无显著差异而不得不终止 [3]。

鉴往：针对过去临床试验失败的检讨与改进

以上的试验失败可能与载体选择、给药频率、给药途径、目标基因选择，甚至是种族、性别、年龄等因素相关。另外，这些疗法当初都是在年轻的动物完成临床前试验，但实际临床试验多是招募病情较严重或年纪较大的病患，而此时血管内皮再生或钙离子循环改善等局部变化可能不足以提升整体运动机能。受试者也可能因为其他生理结构老化或恶化太快，因而盖过治疗进步幅度，导致临床效果不显著。

知来：新技术带来的新希望

由以上分析可知，设计试验时须明确制定患者族群，同时也需要设计不易受其他因素干扰的评估指标。也许基因疗法只适合刚发生心血管疾病的青壮年患者，不适合用于长期罹患心脏衰竭的年迈患者。又诸如跑步机运动表现这类的临床评估指标，其实可推想每个人的运动表现本来就有其个别极限，没有生病前连400公尺都跑不到的人，很难想像用基因治疗后就能突飞猛进，这是不可能的。故利用心脏磁振灌流造影 (cardiac magic resonance perfusion imaging) 与正子摄影 (PET) 等进阶影像工具，或许可以更客观、细致地侦测生理变化，进而验证基因治疗的效果。

虽然基因治疗至今为止可说是失败重重，但新技术仍持续问世，也陆续发现各种极具潜力的新基因标的，像是在调控细胞复制、分化、钙离子恒定、心肌收缩力、及凋亡皆占有一席之地的 S100 蛋白质家族基因 [4]、可调控心脏功能并防止心肌细胞 DNA 损伤与细胞凋亡的 BRCA1 基因 [5]、抑制细胞凋亡的 Fas 蛋白之 anti-Fas 基因 [6]，和可诱导干细胞发挥修复功能的 SDF-1/CXCR4 路径相关基因 [7-9] 等。未来的趋势也将是针对一整套基因进行调控 (如 VEGF 加 Ang-1) [10]，因为单一基因的改变也许不足以逆转大局。

另外，为避免基因治疗偏离标的，超音波微气泡转染 (ultrasound-targeted microbubble destruction, UTMD) 在近几年逐渐崭露头角。其原理是将含特殊基因的载体置入微气泡，再以心导管打到受损心肌附近，藉超音波诱导微气泡至目标组织，然后于适当时机诱发微气泡破裂让基因进入心肌细胞。其优点有低侵入性、低毒性、低致敏性、与能够针对特定目标进行转染；缺点则包括微气泡体积过大不易穿过血管壁，以及稳定存在时间过短而需要多次给药以加强疗效。此技术在动物实验已获得许多令人振奋的成果，故研究人员正积极评估用于人类基因治疗的可行性 [11]。未来希望借由不断推陈出新的技术，加上从过去失败汲取的宝贵经验，最终可让更多受苦受难的心血管疾病患者能借由基因治疗，重获光明的人生。

参考文献：

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话题： 心血管疾病

求一医学标书的样本

　　目前，移植排斥反应仍然是制约肝移植疗效的主要原因。虽然由于免疫抑制剂的临床应用，肝移植的1年的存活率大幅度提高，已超过了80%。但是终生服用免疫抑制剂不仅成为患者沉重的经济负担，而且造成机体的免疫功能低下，可能促进肝炎及肿瘤复发，诱发感染、肿瘤等疾病。因此，找寻诱导特异性移植耐受的新方法，是克服移植排斥反应的最佳途径。
　　特异性移植耐受是指在无需使用免疫抑制药物的情况下，受者的免疫系统对同种异体或异种供体抗原长期不发生免疫反应，而对其它抗原可发生正常免疫应答的状态。目前认为，诱导机体产生免疫耐受涉及免疫清除、免疫失能、免疫抑制和免疫忽视四类机制[1]。根据以上诱导免疫耐受的机制，学者们发展出许多诱导移植耐受的新方法[2]：(1)在胸腺内直接注射表达供体抗原的细胞，在胸腺内通过克隆清除诱导免疫耐受。(2)利用骨髓移植造成造血细胞嵌合体诱导耐受。(3)阻断T细胞活化的共刺激信号通路。(4)输注供体树突状细胞(Dentritic cell，DC)诱导耐受。(5)针对T细胞粘附和活化相关分子的单克隆抗体：抗T细胞及T细胞亚群的单抗；抗粘附分子或细胞因子的单抗。(6)其它特异性免疫抑制的方法：合成肽阻断TCR对同种异体抗原的识别；合成肽阻断趋化因子及其受体。以上方法均不同程度地诱导了对供体抗原的耐受，但它们存在如下不足：(1)成年人胸腺已经萎缩，无法在胸腺内直接注射表达供体抗原的细胞，故该方法适用范围大大受限。(2)供体骨髓移植能诱导部分耐受，但不易控制嵌合程度，移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)的发生率大大增加。(3)DC诱导的淋巴细胞失能状态可通过给予外源性IL-2而逆转；感染或其它因素引起机体强烈的免疫应答，产生大量的IL-2等细胞因子也可以通过旁效应解除失能的细胞克隆；失能状态的维持需要抗原的持续存在，抗原的去除也能逆转失能。(4)阻断协同刺激通路、应用针对T细胞粘附和活化相关分子的单克隆抗体、合成肽阻断TCR对同种异体抗原的识别、阻断趋化因子及其受体等方法能诱导出确切的免疫抑制，但是其作用范围是全身性的、非特异性的，且一旦中止阻断剂的供给，则移植耐受消失。总之， 目前诱导移植耐受的方法存在非特异性、容易逆转、实际操作困难等缺陷。
　　肝移植排斥反应启动时，首先表现为淋巴细胞对汇管区中央静脉周围的浸润，随着排斥反应的进展，淋巴细胞的损伤导致小叶间胆管上皮细胞、中央静脉内皮细胞的炎症，最后波及汇管区周围的肝实质细胞，造成广泛的肝脏炎性反应。因此肝移植排斥反应的过程是从汇管区启动，进而扩展至小叶间胆管上皮细胞、中央静脉内皮细胞、汇管区周围的肝实质细胞。移植排斥反应发生时，CTL细胞在活化后可以通过以下两条途径杀伤靶细胞：(1)穿孔素/颗粒酶途径。(2)Fas/FasL途径：在CTL细胞识别靶细胞后，细胞表面表达的高水平FasL与靶细胞表面的Fas相互识别，通过Fas触发靶细胞内部的凋亡程序，使靶细胞发生程序性死亡。体外实验证实两条途径相互独立。然而体内实验证实单一阻断Fas/FasL途径即可抑制CTL对靶细胞的杀伤，其原因可能与体内环境有关28.
　　诱骗受体3(Decoy receptor 3，DcR3)是一种新发现的可结合FasL的可溶性TNFR超家庭成员，RNA印迹表明DcR3 mRNA 表达于胎肺、脑、肝及成人脾、结肠和肺，特别是在肺癌和结肠癌细胞系的表达很高，也可由T细胞丝裂原激活的外周血单核细胞分泌。DcR3 分子质量为35kDa，肽链长300个氨基酸残基。DcR3 的配体是LIGHT、FasL、TL1A。其主要作用有：(1)与Fas竞争性结合FasL，阻断FasL所诱导的细胞凋亡，这一作用可以减弱CTL和NK细胞对靶细胞的杀伤[14]。(2)通过抑制LIGHT与HveA 或TR2之间的双向信号转导、TL1A至DcR3的单向信号转导来抑制T细胞激活。7 (3)抑制CXCL12/基质细胞来源的因子1α(SDF-1α) 、FasL对T细胞的趋化作用，从而减少CD4+和CD8+T细胞对肿瘤的浸润。25. 27．(4)通过调节DC分化和成熟从而抑制CD4+ T细胞增生。20．(5)抑制T细胞伪足形成，阻止它们形成不可分离的细胞簇从而调节T细胞与其它细胞如APC的相互作用。7
　　因此根据其作用机理，人们推测其可能有以下四方面的作用(1)肿瘤细胞逃避免疫监视。（2）抗炎作用。(3)致癌作用。（4）诱导移植耐受。目前的研究工作已经肯定DcR3基因对肿瘤细胞逃避免疫监视、抑制炎症反应的作用，但DcR3基因的高表达与细胞癌变无相关性，不是癌基因。Wu等证实DcR3减少了FasL、IFN-γ诱导的胰岛细胞凋亡及胰岛素释放，可防止同种异基因胰岛移植时的胰岛原发性无功能。2Zhang等于心脏移植术前一天开始连续7天静脉注射DcR3，小鼠心脏存活时间比对照组延长3.3天，提示DcR3可以减弱T细胞对同种异体抗原的反应。24我们利用腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)（AAV Helper－Free System, Stratagene 公司）作为DcR3基因的载体，将AAV病毒颗粒从门静脉、肝动脉、胆管注入冷保存时的供肝，成功实现了DcR3基因在供肝的表达，在没有使用免疫抑制剂的情况下，供肝正常存活了105天（目前仍然存活，继续观察中），而对照组仅存活了15天（见研究工作基础）。AAV Helper－Free System的特点有：病毒载体产生、效价滴定阶段均不需野生型腺病毒共感染，因此有极高的生物安全性、宿主的免疫反应极小；AAV可感染的细胞类型广泛，感染不依赖于活跃的细胞分裂；AAV病毒滴度高，常规可达107病毒颗粒/ml，经浓缩可达1012病毒颗粒/ml；AAV在允许复制的条件下可在染色体外复制，在不能复制的条件下可以5-10%的效率定点整合入宿主19号染色体的一个2-4kb的区域，因此AAV被证明有应用于基因长期表达的价值。我们目前的研究工作的特色有：（1）证明了腺相关病毒携带的DcR3基因可以诱导肝移植耐受。(2)采用AAV Helper－Free System克服了逆转录病毒载体转导效率低、随机整合入受者染色体中而致肿瘤的危险的缺点[1]以及腺病毒载体虽然有较高的转导率,但因不能在染色体外复制或整合入受者染色体中,目的基因只能一过性表达的缺点[2]。我们目前研究工作的缺陷有：（1）DcR3基因仅在肝脏血管内皮细胞、胆管上皮细胞表达，而急性排斥反应启动时CTL细胞首先浸润的是汇管区的中央静脉周围，因此它尚不能阻止急性排斥反应的启动，仅能阻止CTL细胞血管内皮细胞、胆管上皮细胞的攻击。（2）DcR3基因转染的血管内皮细胞、胆管上皮细胞是成熟的细胞。虽然携带DcR3基因的AAV可在染色体外复制或整合入宿主基因组而使DcR3基因存在长期表达的可能，但是成熟细胞存在新老交替，DcR3基因的表达随着细胞的死亡而消失。因此为了完善我们目前的研究工作，我们需要作以下的改进：（1）将DcR3基因的表达定位于汇管区中央静脉周围，抑制排斥反应的启动。如能进一步将DcR3基因表达于血管内皮细胞、胆管上皮细胞、肝细胞，则更能防止个别活化的CTL细胞对它们的攻击，从而形成抑制排斥反应的“双保险”。（2）实现DcR3基因的持续表达。
　　肝干细胞（Hepatic Stem Cell，HSC）是指具有自我更新能力和具有分化形成肝细胞与胆管细胞潜能的原始细胞。最近有人证实它尚可分化为血管内皮细胞(Gao Z, McAlister VC, Williams GM. Repopulation of liver endothelium by bone-marrow-derived cells. Lancet. 2001 Mar 24;357(9260):932-3.) [11]。肝干细胞的基本特征可概括为两点：①具有多向分化能力，可向肝细胞、胆管上皮细胞、肝脏血管内皮细胞分化。②具有自我更新与自我维持能力，对肝脏损伤或疾病产生反应并进行修复。其形态特点是细胞体积小、核大而胞质少、呈卵圆形、具有特殊的表面标志如AFP、肝细胞标志（白蛋白）、胆管上皮细胞标志（CK7、CK19）以及肝细胞、胆管上皮细胞共有的标志(CK8、CK18)。目前有人证实其尚有血管内皮细胞的标志。
　　该类细胞不仅在胚胎肝组织中存在，而且在成年肝组织中也存在。肝内的肝干细胞称为卵圆细胞(Hepatic Oval Cell，HOC)或小肝细胞。它们在正常情况下位于肝脏汇管区的Hering小管[D]，当肝脏受到损伤（肝毒性药物、手术、创伤、缺血再灌注等）时，它们迅速增生分化，补充受损的肝细胞、胆管上皮细胞、肝脏血管内皮细胞分化，因而被称为肝干细胞池[A]。目前大量文献证实，肝脏损伤时，肝脏有三个水平的细胞修复：肝细胞、Hering 小管的双向干细胞、Hering小管周围的来自骨髓的肝干细胞。骨髓来源的干细胞可定居于Hering小管周围，在肝脏损伤时发挥修复作用[K]。Theise ND等通过三维观测得出Hering 小管、汇管区周围是肝干细胞存在的场所的结论[G]。Petersen 证实肝内存在骨髓来源的干细胞，Theise 大鼠2%，人4-40%。Alison0.5-2%(hsc8,78,79)。Lagasse 30%.认为Hering管可能是人肝干细胞起源分化及滞留场所(TheiseND,SaxenaR,PortmannBC,etal.Thecanalsofheringandhepaticstemcellsinhumans[J].Hepa-tology,1999,30:1425-1433.)

　　肝干细胞的肝外来源包括胰腺的上皮细胞、胰岛前体细胞、骨髓造血干细胞[3,4]。自1999年Petersen等发现肝卵圆细胞可来源于骨髓后,从骨髓细胞中鉴定肝干细胞成为近年研究的热点。目前研究证实从骨髓中分离纯化的造血干细胞的多个亚群在一定的微环境或细胞因子的诱导下可分化为肝干细胞[B]。目前,在骨髓中已发现多种细胞亚群具有分化为肝细胞的潜能,如KTLS细胞(c-kithighThylowLin-Sca-1+)[H]、β2-m-Thy-1+细胞[12]、CD44-CD45-HLA-c-kit-的多能成体前体细胞(multipotent adult progenitor cells, MAPC)[I]及C1qRp+细胞(Lin-CD45+CD38-CD34+/-)[J]等。这些细胞均涉及多个不同的表面标志,可能代表着骨髓干细胞的不同发育阶段或谱系中的不同分支。这些细胞因子肯定存在于细胞的微环境中，包括细胞外基质中参与粘附过程的信号分子以及参与正常细胞发育、分化、成熟的细胞因子[B] [E]。Petersen 等[L]、Theise等[M,N]和Alison等[O]的研究相继指出,骨髓干细胞或造血干细胞能够在鼠肝内转化成为肝卵圆细胞甚至成熟的肝细胞和胆管细胞,并同时证明这种现象也存在于人类体内。用高浓度的肝细胞生长因子(HGF)诱导体外培养的大鼠骨髓细胞,RT-PCR检测到白蛋白及AFP的表达,免疫细胞化学也证实了经诱导的细胞出现了AFP、白蛋白及CK8/18等肝前体细胞的特征性表达。应用磁株细胞筛选法分离人或大鼠骨髓细胞中的β2m-Thy-1+细胞,能够表达肝细胞的特征[P]。这些骨髓来源的肝干细胞(BDHSC)肝内移植后很快就整合入肝板,并且分化为成熟的肝细胞,而在体外培养的过程中加入胆汁化血清可促进它们向肝细胞方向分化。蔡云峰等用免疫磁珠法成功分离出骨髓干细胞的多个亚群，并证明大鼠骨髓内β2微球蛋白阴性(β2 m- ) 细胞经体外培养诱导后呈多角形细胞表现, 白蛋白、AFP、 CK8 / 1 8表达阳性，其他干细胞类型未见类似变化。提示该亚群骨髓干细胞有向肝干细胞分化的能力。我们参照他们介绍的方法成功分离了1.5×105数量级的肝干细胞纯度为95%，培养7天后可达2×106数量级。经免疫组化染色证明其有肝细胞、胆管上皮细胞、血管内皮细胞的特异性标志，因此推测其可能分化为以上3种细胞（见研究工作基础）。这些研究结果都说明骨髓细胞中存在有能分化为肝细胞的干细胞群。
　　肝脏基因治疗的一大难题是被用作基因修饰的成熟肝细胞在体外不易扩增和传代，肝干细胞具有强大的增殖能力，即使经过基因修饰仍有可能传代，这为克服目前基因治疗中的主要问题开辟了新的途径。以肝干细胞作为载体具有一次性介入，永久性治疗的特点，且永生化的肝干细胞无致癌的危险性[F]。
　　基于以上研究成果，我们设想利用肝干细胞在肝脏汇管区中央静脉周围的靶向定植并在必要时分化补充受损或衰老的血管内皮细胞、胆管上皮细胞、肝细胞的生物学特性，以腺相关病毒为载体将DcR3基因转入从雄性近交系Wistar大鼠骨髓中分离纯化的肝干细胞，将雌性近交系Wistar大鼠肝脏植入雌性近交系Lewis大鼠，同时将转染DcR3基因的肝干细胞经门静脉注入移植后的肝脏。DcR3基因随着肝干细胞的定植主要在汇管区持续表达，必要时部分随着肝干细胞的进一步分化而表达在血管内皮细胞、胆管上皮细胞、肝细胞，从而在启动（主要）、攻击（次要）两个环节抑制排斥反应的发生。DcR3基因强大的免疫抑制作用被局限在肝脏之中，从而诱导出特异针对肝脏的移植耐受状态。
　　参考文献
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　　2.项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键问题。（此部分为重点阐述内容）
　　2.1 研究内容
　　2.1.1构建携带DcR3基因的腺相关病毒载体，并将其转染AAV293细胞，收集AAV病毒颗粒备用。
　　2.1.2从雄性近交系Wistar大鼠股骨、胫骨抽取骨髓，分离出肝干细胞，用上述腺相关病毒颗粒转染，并进行表达鉴定。
　　2.1.3将雌性近交系Wistar大鼠肝脏植入雌性近交系Lewis大鼠，同时将转染的雄性近交系Wistar大鼠的肝干细胞经门静脉注入肝脏。
　　2.1.4根据Y染色体及AAV病毒载体自带的绿色荧光蛋白（GFP）标志确定转基因肝干细胞在供肝中的定植、分布情况。
　　2.1.5检测转入肝干细胞的DcR3基因在供肝中的表达情况。
　　2.1.6观测肝移植术后移植排斥反应的发生情况。
　　2.2研究目标：本课题拟构建携带DcR3基因的腺相关病毒，将其转染雄性近交系Wistar大鼠骨髓来源的肝干细胞；将雌性近交系Wistar大鼠肝脏植入雌性近交系Lewis大鼠，同时将转染DcR3基因的肝干细胞经门静脉注入移植后的肝脏；使DcR3基因在供肝中长期表达，从而诱导特异针对肝脏的移植耐受状态。探讨：(1)转基因肝干细胞在供肝中的定植、分布情况。(2)转入肝干细胞的DcR3基因在供肝中的表达情况。(3)转基因肝干细胞在供肝中的分布及其基因表达与移植耐受的关系。
　　2.3拟解决的关键问题
　　2.3.1腺相关病毒转染肝干细胞的效率：干细胞的基因转染难度较大，是本课题的关键环节之一。本课题成员（删去）于2001年用腺病毒成功感染了神经干细胞，成功率约 80%～90%，且经传代培养 12代后仍具干细胞特性。腺相关病毒转染效率高于腺病毒，转染的细胞类型较腺病毒更广泛。因此本课题组有能力完成腺相关病毒对肝干细胞的转染。
　　2.3.2转基因肝干细胞在供肝汇管区中定植的数量：肝干细胞在汇管区的定植数量与肝脏受到的损伤程度有关。损伤越重，肝干细胞在汇管区的定植数量越多，反之亦然。肝移植时肝脏缺血再灌注对肝脏已是一种损伤，为了进一步提高肝干细胞在汇管区的定植数量，可在冷保存时切除大鼠肝脏的一叶，然后完成肝移植。
　　3.拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）
　　3.1研究方案
　　3.1.1 DcR3基因的克隆，参照Pitti RM等介绍的方法进行。
　　3.1.2构建携带DcR3基因的腺相关病毒载体，并用其感染AAV－293细胞进行体外表达鉴定、收集AAV病毒颗粒备用。
　　3.1.3从雄性近交系Wistar大鼠股骨、胫骨抽取骨髓，分离肝干细胞并进行纯化、鉴定，参照Itzhak Avital等介绍的方法进行。
　　3.1.4腺相关病毒载体转染肝干细胞，采用直接感染方法。
　　3.1.5体外试验：表达DcR3基因的肝干细胞抑制FasL诱导淋巴细胞凋亡试验；表达DcR3基因的肝干细胞抑制FasL诱导的淋巴细胞趋化试验
　　3.1.6动物实验：大鼠肝移植采用袖套法，移植完成时将转染DcR3基因的肝干细胞经门静脉注入肝脏；分别于术后3天、7天、14天、21天、28天取血液及肝脏标本，采用常规生化法检测肝功能，Northern blot、Western blot检测DcR3基因在肝脏中的表达情况，免疫组化法检测受体CD4+、CD8+淋巴细胞在供肝中的浸润情况，TUNEL法检测供肝中细胞凋亡情况，常规石蜡切片HE染色观察移植排斥反应的发生情况。
　　3.2技术路线

　　3.3可行性分析
　　3.3.1理论上，骨髓来源的肝干细胞是肝脏汇管区卵圆细胞、嗜碱性小肝细胞的前体细胞。研究证明经门静脉注入的肝干细胞定植的肝脏汇管区的Hering小管，可分化为血管内皮细胞、胆管上皮细胞、肝细胞。汇管区是肝移植排斥反应时CTL细胞首先浸润的区域，血管内皮细胞、胆管上皮细胞、肝细胞是CTL细胞攻击的靶细胞。因此肝干细胞将转染的免疫抑制基因带入肝脏并汇管区及血管内皮细胞、胆管上皮细胞、肝细胞中持续表达，从而诱导特异针对肝脏的移植耐受状态在理论上是可行的。
　　3.3.2本研究所涉及的技术均为成熟的免疫学技术；本研究所拥有本研究所需的设备和条件。
　　4.本项目的特色与创新之处。
　　本研究利用了肝干细胞在肝脏定植、分化的靶向性，将其作为免疫抑制分子的载体，使非特异性的免疫抑制分子的作用局限于肝脏之中，克服了免疫抑制分子作用范围过大的缺点，从而诱导特异针对肝脏的移植耐受状态。
　　5.年度研究计划及预期研究结果。（包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等）
　　年度研究计划
　　2005.01-2005.09 DcR3基因的克隆，构建携带DcR3基因的腺相关病毒载体备用。
　　2005.10-2006.06 分离、纯化、鉴定雄性近交系大鼠骨髓来源的肝干细胞，并用腺相关病毒进行转染；DcR3基因的体外表达鉴定；所转染的DcR3基因的体外功能实验。
　　2006.07-2007.06 完成肝移植的动物模型，将转染后的肝干细胞经门静脉注入肝脏。按期取肝脏标本，根据Y染色体标志染色及GFP，确定转基因肝干细胞在供肝中的定植、分布情况；检测转入肝干细胞的基因在肝脏中的表达情况；移植排斥反应的发生情况。
　　2007.07-2007.12 补充实验遗漏，整理实验资料，统计处理实验数据，撰写论文。
　　预期研究结果
　　1.证明转染DcR3基因的肝干细胞能在供肝汇管区及部分血管内皮细胞、胆管上皮细胞、肝细胞中持续表达，同时诱导出长期的肝移植免疫耐受。
　　2.在国外学术期刊上发表论文2-3篇，在国内核心期刊发表论文6-8篇，并在国内学术会议交流。
　　(二）研究基础与工作条件
　　1.工作基础（与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩）
　　2月底至3月初出结果。
　　2.工作条件（包括已具备的实验条件，沿缺少的实验条件和拟解决的途径，包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况。）
　　删去
　　3.申请人简历（包括申请者和项目组主要成员的学历和研究工作简历，近期已发表与本项目有关的主要论著目录和获得学术奖励情况及在本项目中承担的任务。）
　　删去
　　（三）经费申请说明（要求按照《国家自然科学基金经费管理办法》认真填写，购置5万元以上固定资产及设备等，须逐项说明与项目研究的直接相关性及必要性。）
　　（四）其他附件清单（附件材料复印后随纸质《申请书》一并上交）（随纸质申请书一同报送的附件清单，如：具有中级技术职称申请者的推荐信或在职研究生申请项目的导师推荐信等。）

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