清华大学用CRISPR解析重要lncRNA

清华大学用CRISPR解析重要lncRNA

2016年08月28日讯 国际学术期刊《Genome Research》在线刊登了清华大学生命科学学院的高冠军博士带领的一项研究成果，题为“Critical roles of long noncoding RNAs in Drosophila spermatogenesis”。这项研究确定了128个睾丸特异性的果蝇lncRNA，并采用CRISPR/Cas9系统解析了它们的重要功能。

本文通讯作者高冠军早年毕业于扬州大学，2005年博士毕业于浙江大学，2006年至2011年在美国国立卫生研究院从事博士后和Research Fellow，2011年至今为清华大学生命科学学院PI、博士生导师。其带领的课题组通过运用实验室在国际上率先建立的CRISPR与phiC31重组酶相结合的高效果蝇基因打靶系统（knock-out和knock-in），综合运用遗传与生化相结合的方法与技术，规模化研究染色质表观遗传学相关因子（如非编码RNA及组蛋白修饰等）在生殖系统及胚胎早期发育进程中的生物学功能及相应的分子作用机制。

长链非编码RNAs（lncRNAs）是最近发现的一类细胞RNAs，在许多细胞发育过程中起着重要的调控作用。虽然lncRNAs已在各种系统中进行了系统性的鉴定，但是在活体动物模型中，它们中的大多数都没有得以功能上的表征。在这项研究中，该研究小组确定了128个睾丸特异性的果蝇lncRNAs，并采用一种优化的三组份CRISPR/Cas9系统，敲除了它们当中的105个。在lncRNA敲除的突变果蝇中，有33只（31%）表现出部分或全部的雄性生育能力丧失，伴有晚期精子发生的可见发育缺陷。

此外，6只敲除果蝇通过一种反式构型的转基因而得以完全或部分修复，从而表明这些lncRNAs主要是反式发挥作用。此外，5个lncRNA突变体的基因表达谱显示，睾丸特异性lncRNAs调节着总体的基因表达，精心策划后期的雄性生殖细胞分化。

与编码基因相比，睾丸特异性lncRNAs演化得更快。此外，具有更大功能重要性的lncRNAs具有较高的序列保守性，这表明它们处于不断的进化选择之下。总的来说，这些研究结果揭示了迅速进化的睾丸特异性lncRNAs在果蝇精子发生后期的关键功能。

此前，研究人员还公布了lncRNA在多种生物过程中的重要作用。例如，日本理化研究所（RIKEN）RNA生物学实验室的Shinichi Nakagawa及其同事发现，一个特别的长非编码RNA（lncRNA），在某些情况下可能对于生育是至关重要的。相关研究结果发表在2015年1月的国际著名期刊《Development》。

长非编码RNA（lncRNA）正成为各种生物学过程的一个关键调控因子，然而，lncRNA在上皮间质转化（EMT）中所起的作用，尚不明确。2015年1月20日，美国H. Lee Moffitt癌症中心和浙江肿瘤医院的研究人员，在《Journal of Biological Chemistry》发表了一项研究成果，解析了lncRNA在乳腺上皮细胞EMT过程中所起的作用。

2014年12月16日，中科院广州生物医药与健康研究院、山东大学、南方医科大学、伯明翰大学和香港大学等处的研究人员，在国际著名学术期刊《Cell Research》发表了一项最新研究成果。这项研究对于lncRNAs在重编程中的作用提供了独特见解，并在p53和异染色质之间建立了一种新的联系。

CRISPR Cas9系统目前的研究热点在什么方面

1.什么是CRISPR/Cas9？
CRISPR----Clustered Regularly Interspaced
Short Palindromic Repeats
是在细菌和古细菌中广泛存在的成簇的、有规律的、间隔的短回文重复序列。07年，发现细菌可以用CRISPR系统抵抗噬菌体的入侵；08年，发现细菌的
CRISPR系统能够阻止外源质粒的转移。是细菌的一种获得性免疫系统。
Cas----CRISPR-associated
CRISPR/Cas9----CRIPSR-
Cas系统分为Type I、TypeII 、Type III三种类型。在TypeII
系统中包含一个标志性的Cas9蛋白（参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌体DNA或外源质粒)。CRISPR/Cas系统和Cas9蛋白结合成复合
体，发挥识别和降解入侵的外源DNA功能。
2.CRISPR/Cas9的优缺点
优点：

构建方便简单快捷
高效的介导基因定点敲入和基因组的点突变
精确的切口酶活性提高了基因治疗的安全性
缺点：

严重的脱靶性
3.CRISPR/Cas9的用途
CRISPR/Cas9被改造成第三代人工核酸内切酶（前两代分别是ZFN和TALEN），用于复杂基因组的编辑，目前该技术应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠及细菌的基因组精确修饰。
4.CRISPR/Cas9目前热点
CRISPR/Cas9有个极大的优势就是可以改造为切口酶，在DNA的特定位置制造单链切口，这样不会引起非同源末端连接，但是可以激活同源细胞的重组。
这套系统目前的主要用途是在以下几个方面：

基因定点InDel突变
基因定点敲入
两位点同时突变
小片段的缺失
编码基因和非编码基因（lncRNA、microRNA）的靶向基因敲除

反义rna抑制基因表达的作用体现在那四个方面

反义lncRNA（antisense lncRNA）是指由基因（通常是蛋白编码基因）的反义链转录，并与该基因的mRNA存在序列重叠的RNA分子。随着对非编码RNA研究的深入，研究发现约70%的基因均有反义lncRNA【1】。更为重要的是，反义lncRNA往往与其正义链基因的表达存在相关性，提示反义lncRNA可能广泛地参与了蛋白编码基因的表达调控。

目前，关于反义lncRNA影响正义链基因表达的作用机制，主要有3类：1.反义lncRNA的转录过程，抑制正义链基因的转录，该机制认为反义链转录事件本身，而不是反义lncRNA，调控了基因的表达。2.反义lncRNA结合DNA或组蛋白修饰酶，调控所在基因座位的表观遗传学，从而影响正义链基因的表达。3.反义lncRNA与正义链mRNA通过碱基互补配对结合，影响mRNA的可变剪接等【2】。

2019年4月4日，来自美国哥伦比亚大学的Tom Maniatis教授在 Cell 上发表研究Antisense lncRNA Transcription Mediates DNA Demethylation to Drive Stochastic Protocadherin a Promoter Choice。该研究首次发现反义lncRNA的转录可以影响DNA甲基化，进而改变染色体结构，促进增强子与启动子的结合，调控Pcdhα基因的表达。该反义lncRNA的作用模型也解释了Pcdhα基因的可变外显子选择机制。

在神经发育过程中，单个神经细胞响应不同的信号分子，会分化为具有不同功能的细胞，并最终形成复杂的神经回路。在此过程中，神经细胞需要区别自身与其他神经元，这就需要一个细胞表面独特的识别蛋白。哺乳动物的Pcdh（Protocadherin，原钙黏附蛋白）就发挥了这样的功能，它具有多个随机启动的可变外显子，可产生多个转录本（isoform）（图1）。

图1. Pcdhα基因
为了研究Pcdhα基因的表达调控，研究者系统地分析了该基因座位的转录情况，惊讶的发现每一个Pcdhα可变外显子的反义链，都存在一个保守的反义lncRNA。利用CRISPR dCas9-VPR系统激活反义lncRNA的表达，会促进相应可变外显子的转录。

那么反义lncRNA是如何促进响应正义转录本的转录的呢？研究者发现，反义lncRNA的转录，会造成该位点DNA去甲基化的发生，从而使远端增强子靠近该外显子的启动子，促进它的表达。如图2所示，Pcdhα基因座位均带有抑制表达的DNA甲基化修饰，而当反义lncRNA表达时，该外显子附近的DNA被DNA去甲基化酶TET3识别，去除了甲基化修饰，cohesin蛋白重塑了染色体的结构，HS5-1增强子与该基因座位的启动子结合，启动相应Pcdhα变体的表达。

图2
该研究从非编码RNA的角度揭示了Pcdhα基因变体的随机选择机制，然而，目前对反义lncRNA的表达驱动尚不清楚。对该问题的解决将有助于更全面的了解神经细胞身份的决定过程。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.03.008

制版人：珂

参考文献

1. Yiping He, Bert Vogelstein, Victor E. Velculescu，The Antisense Transcriptomes of Human Cells，SCIENCE VOL 322 19 DECEMBER 2008

2. Mohammad Ali Faghihi and Claes Wahlestedt，Regulatory roles of natural antisense transcripts.NATURE REVIEWS, VOlUME 10 | SEpTEMBER 2009 | 637

本文地址:http://www.dadaojiayuan.com/jiankang/302249.html.

声明： 我们致力于保护作者版权，注重分享，被刊用文章因无法核实真实出处，未能及时与作者取得联系，或有版权异议的，请联系管理员，我们会立即处理，本站部分文字与图片资源来自于网络，转载是出于传递更多信息之目的,若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请立即通知我们(管理员邮箱：douchuanxin@foxmail.com)，情况属实，我们会第一时间予以删除，并同时向您表示歉意,谢谢!

上一篇: Lancet:利用Affymetri···

下一篇: 治愈HCV感染，我们需要付出多大代价···